Основні принципи і методи виділення чистих культур мікроорганізмів

Бактеріологічне дослідження

Бактеріологічний метод дослідження є найважливішим у практичній діяльнос­ті будь-якої мікробіологічної лабораторії. Від правильного його виконання ­залежить визначення етіологічного чинника, що викликав захворювання, і, відповідно, вибір тактики лікування інфекційного хворого. Важливість цього методу пояснюється тим, що в багатьох випадках лікарі мають справу з мікробними асоціаціями, тоді необхідно встановлювати роль кожного з мікробів у виникненні хвороби.

Тому перед освоєнням основних принципів і методів виділення чистих культур необхідно оволодіти технікою посівів і пересівів бактерій в рідкі й на щільні живильні середовища.

Техніка посівів мікроорганізмів. Посіви проводять як з метою виділення збудників із досліджуваного матеріалу від хворих, так і для нагромадження чистих культур з метою подальшого їх вивчення та ідентифікації. Техніка посівів у рідкі та на щільні живильні середовища має свої особливості.

У ліву руку беруть дві пробірки. В одній знаходиться живильне середовище (щільне або рідке), в іншій – досліджуваний матеріал. Пробірки затискають великим та вказівним пальцями. Для того, щоб можна було спостерігати за вмістом пробірок, їх тримають зверху кисті руки. Пробірки повинні бути дещо нахиленими, і потрібно стежити, щоб при відкриванні їх матеріал або сторонні мікроби з повітря та навколишніх предметів з однієї не потрапили в іншу. Корки з пробірок виймають, тримаючи їх 4 і 5 пальцями правої руки. Трьома іншими пальцями правої руки, як олівець, тримають бактеріологічну петлю або піпетку, якими розподіляють досліджуваний матеріал.

Спочатку стерилізують петлю у верхній ­частині полум’я газового пальника. Пробірки відкривають і край їх проносять через полум’я пальника. Петлю опускають у пробірку, де є до­сліджуваний матеріал, і, обережно торкаючись стінки, охолоджують. У подальшому петлю опускають у пробірку і набирають матеріал. Якщо він знаходиться у рідкому стані, для посіву достатньо краплі рідини, яка затримується в кільці бактеріологічної петлі. Коли використовують мікроби, що виросли на поверхні середовища, обережно плавним рухом набирають невелику кількість їх, стежачи, щоб не ушкодити живильне середовище. Петлю повільно виймають з пробірки, не торкаючись її стінок, і переносять в іншу пробірку з середовищем. Штриховими рухами від однієї стінки пробірки до іншої, починаючи з нижньої частини середовища, проводять посів матеріалу по скошеній поверхні агару знизу догори.

Петлю виймають з пробірки, корки і краї пробірок проносять через полум’я і закривають. Петлю прожарюють у полум’ї, щоб знищити мікроорганізми.

При посіві матеріалу на рідке живильне середовище петлю з матеріалом занурюють у рідину. Якщо він не знімається з петлі, його обережно розтирають на стінці пробірки й омивають середовищем.

Матеріал, який набирали пастерівською або градуйованою піпеткою, вилива­ють у живильне середовище, а для рівномірного розповсюдження його пробірку обе­режно, щоб не замочити корок, струшують або обертають, затиснувши в ­долонях.

Для посіву матеріалу на щільне живильне середовище у чашках Петрі невелику кількість матеріалу набирають стерильною петлею і втирають у поверхню середовища біля краю чашки.

Після цього петлю стерилізують у полум’ї, щоб знищити надлишок матеріалу, охолоджують. Наступний етап посіву починають з місця, де закінчився попередній. Петлю кладуть горизонтально на поверхню агару, де було зроблено посів, проводять один-два рази по поверхні і роблять посів по решті середовища. Необхідно намагатись, щоб штрихи посіву тривали від краю до краю чашки, не пошкоджували поверхні агару і розташовувались близько один до одного. Цим штучно подовжується лінія посіву і створюються можливості для одержання ізольованих колоній.

Посів шпателем і тампоном у чашки Петрі. Матеріал попередньо наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки петлею або піпеткою. Стерильний шпатель проносять через полум’я, охолоджують, торкаючись стінки чашки. Обережними круговими рухами, тримаючи чашку напівзакритою, розпо­діляють матеріал рівномірно по поверхні середовища.

При посіві тампоном чашку дещо відкривають однією рукою, тампоном торкаються поверхні агару біля краю чашки і починають проводити посів штрихами від краю до краю чашки, втираючи обережно матеріал у поверхню середовища, не пошкоджуючи його, поступово обертаючи тампон. Після проведення посіву чашку обертають на 90° і повторюють посів перпендикулярно до попереднього.

При посіві уколом у стовпчик живильного середовищапробірку з м’ясо-пептонним агаром, желатином тощо беруть у ліву руку, петлю з матеріалом – у праву і роблять укол до дна пробірки в середовище. Петлю обережно виймають, а пробірку закривають.

Посів матеріалу в товщу живильного середовища. Перед посівом матеріал повинен бути в рідкому стані. Стерильною градуйованою піпеткою набирають 0,1, 0,5 або 1,0 мл матеріалу і виливають його в стерильні чашки Петрі. Після цього матеріал заливають 15-20 мл розтопленого й охолодженого до 45-50 °С МПА. Обережно похитуючи чашку, круговими рухами по поверхні стола перемішують в ній матеріал, досягаючи його рівномірного розподілу в середовищі. Чашку залишають закритою до повного застигання агару, а потім перевертають догори дном.

Для того, щоб виділити чисту культуру мікроорганізмів, слід відділити численні бактерії, які знаходяться в матеріалі, одна від одної. Це можна досягнути за допомогою методів, які засновані на двох принципах – механічному і біологічному роз’єднанні бактерій.

Методи виділення чистих культур, засновані на механічному принципі

Метод послідовних розведень, запропонований Л. Пастером, був одним із найперших, який застосовувався для механічного роз’єднання мікроорганізмів. Він полягає в проведенні послідовних серійних розведень матеріалу, який містить мікроби, в стерильному рідкому живильному середовищі. Цей прийом достатньо кропіткий і недосконалий у роботі, оскільки не дозволяє контролювати кількість мікробних клітин, які попадають у пробірки при розведеннях.

Цього недоліку не має метод Коха (метод пластинчастих розведень). Р. Кох використовував щільні живильні середовища на основі желатину або агар-агару. Матеріал з асоціаціями різних видів бактерій розводився у декількох пробірках з розтопленим і дещо охолодженим желатином, вміст яких пізніше виливався на стерильні скляні пластини. Після застигання середовища воно культивувалось при оптимальній температурі. У його товщі утворювались ізольовані колонії мікроорганізмів, які легко можуть бути перенесені на свіже живильне середовище за допомогою платинової петлі для одержання чистої культури бактерій.

Метод Дригальського є більш досконалим методом, який широко розповсюджений в повсякденній мікробіологічній практиці. Спочатку на поверхню сере­довища в чашці Петрі піпеткою або петлею наносять досліджуваний матеріал. За допомогою металевого або скляного шпателя його ретельно втирають у середовище. Чашку під час посіву тримають привідкритою і обережно обертають, щоб рівномірно розподілити матеріал. Не стерилізуючи шпателя, проводять ним посів матеріалу в іншій чашці Петрі, при потребі – в третій. Тільки після цього шпатель занурюють у дезінфікуючий розчин або прожарюють у полум’ї пальника. На по­верх­ні середовища в першій чашці спостерігаємо, як правило, суцільний ріст бакте­рій, у другій – густий ріст, а в третій – ріст у вигляді ізольованих колоній.

Метод штрихових посівів сьогодні використовується в мікробіологічних лабораторіях найчастіше. Матеріал, який містить мікроорганізми, набирають бактеріологічною петлею і наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки. Знімають надлишок матеріалу і проводять посів його паралельними штрихами від краю до краю чашки. Через добу інкубації посівів при оптимальній температурі на поверхні чашки виростають ізольовані колонії мікробів.

Для одержання ізольованих колоній можна використати посів тампоном, яким проводили забір досліджуваного матеріалу. Дещо привідкривають чашку Петрі із живильним середовищем, вносять туди тампон і обережними рухами втирають матеріал у поверхню чашки, повертаючи поступово тампон і чашку.

Таким чином, істотна перевага методів пластинчастих розведень Коха, Дригальського і штрихових посівів полягає в тому, що вони створюють ізольовані колонії мікроорганізмів, які при інокуляції на інше живильне середовище перетворюються в чисту культуру

Методи виділення чистих культур, засновані на біологічному принципі

Біологічний принцип роз’єднання бактерій передбачає цілеспрямований пошук методів, які враховують численні особливості мікробних клітин. Серед найпоширеніших методів можна виділити наступні:

1. За типом дихання. Всі мікроорганізми за типом дихання поділяються на дві основні групи: аеробні (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae тощо) та анаеробні (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens та ін.). Якщо матеріал, з якого слід виділити анаеробні збудники, попередньо прогріти, а потім культивувати в анаеробних умовах, то виростуть саме ці бактерії.

2. За спороутворенням. Відомо, що деякі мікроби (бацили і клостридії) здатні до спороутворення. Серед них Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Спори стійкі до дії факторів зовнішнього середовища. Отже, досліджуваний матеріал може бути підданий дії термічного фактора, а потім інокулятивно перенесений в живильне середовище. Через деякий час на ньому виростуть саме ті бактерії, які здатні до спороутворення.

3. Стійкість мікробів до дії кислот і лугів. Деякі мікроби (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) внаслідок особливостей їх хімічної будови стійкі до дії кислот. Ось чому матеріал, який їх містить, наприклад, харкотиння при туберкульозі попередньо обробляють рівним об’ємом 10 % розчину сірчаної кислоти, а потім висівають на живильні середовища. Стороння флора гине, а мікобактерії внаслідок їх резистентності до кислот, виростають.

Холерний вібріон (Vibrio сholerae), навпаки, є галофільною бактерією, тому для створення оптимальних умов росту його висівають на середовища, які містять луг (1 % лужна пептонна вода). Вже через 4-6 год на поверхні середовища з’являються характерні ознаки росту у вигляді ніжної голубуватої плівки.

4. Рухомість бактерій. Деякі мікроби (Proteus vulgaris) мають тенденцію до повзучого росту і здатні швидко розповсюджуватись по поверхні дещо вологого середовища. Для виділення таких збудників їх засівають у краплинку конденса­ційної рідини, яка утворюється при охолодженні стовпчика скошеного агару. ­Через 16-18 год вони розповсюджуються на всю поверхню середовища. Якщо взяти матеріал з верхньої частини агару, будемо мати чисту культуру збудників.

5. Чутливість мікробів до дії хімічних речовин, антибіотиків та інших протимікробних засобів.Внаслідок особливостей метаболізму бактерій вони можуь мати різну чутливість до деяких хімічних чинників. Відомо, що стафілококи, аеробні бацили, що утворюють спори, стійкі до дії 7,5–10 % хлориду натрію. Ось чому для виділення цих збудників використовують елективні живильні середовища (жовтково-сольовий агар, маніт-сольовий агар), які містять саме цю речовину. Інші бактерії при такій концентрації хлориду натрію практично не ростуть.

6. Введення деяких антибіотиків (ністатин) використовується для гальмування росту грибів у матеріалі, який сильно контамінований ними. І, навпаки, додавання антибіотика пеніциліну до середовища сприяє інгібуванню росту бактеріальної флори, якщо треба виділити гриби. Додавання фуразолідону в певних концентраціях до живильного середовища створює селективні умови для росту коринебактерій і мікрококів.

7. Здатність мікроорганізмів проникати через неушкоджені шкірні покриви. Деякі патогенні бактерії (Yersinia pestis) внаслідок наявності великої кількості ферментів агресії здатні проникати через непошкоджену шкіру. Для цього шерсть на тілі лабораторної тварини голять і в цю ділянку втирають досліджуваний матеріал, який містить збудника і велику кількість стороньої мікрофлори. За деякий час тварину забивають, а з крові або внутрішніх органів виділяють ­мікроби.

8. Чутливість лабораторних тварин до збудників інфекційних захворювань.Окремі тварини проявляють високу чутливість до різних мікроорганізмів. Наприклад, при будь-якому способі введення Streptococcus pneumoniae білим мишам у них розвивається генералізована пневмококова інфекція. Аналогічна картина спостерігається при зараженні гвінейських свинок збудниками туберкульозу (Mycobacterium tuberculosis).

3. ЕТАПИ ВИДІЛЕННЯ ЧИСТИХ КУЛЬТУР МІКРООРГАНІЗМІВ ТА ЇХ ІДЕНТИФІКАЦІЯ

У повсякденній практиці бактеріологи користуються такими поняттями як штам і чиста культура мікроорганізмів. Під штамом розуміють мікроби одного виду, які виділено з різних джерел, або з одного й того ж самого джерела, але в різний час. Чиста культура бактерій – це мікроорганізми одного виду, нащадки однієї мікробної клітини, які виросли на (в) живильному середовищі.

1. Етапи виділення чистої культури

1. макро-i мiкроскопiчне вивчення дослiджуваного матерiалу i посiв на щiльнi поживнi середовища для одержання окремих колонiй;

2. макро-i мiкроскопiчне вивчення колонiй i пересiв на скошений агар;

3. перевiрка чистоти виділеної культури та її iдентифiкацiя;

4. висновок про видiлену культуру.

Етапи виділення чистих культур мікроорганізмів та їх ідентифікація

Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з ряду етапів.

У перший день (І етап дослідження) у стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал. Його вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом та іншим ознаками, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища, на які засіватиметься матеріал. Посів проводять бактеріологічною петлею (застосовується найчастіше), за допомогою шпателя за методом Дригальського, ватно-марлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять у термостат при оптимальній температурі (37 °С) на 18-48 год. Мета етапу – одержати ізольовані колонії мікроорганізмів.

Однак, деколи з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі живильні середовища.

На другий день (ІІ етап дослідження) на поверхні щільного живильного сере­довища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія – це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Особливості росту бактерій на живильних середовищах є проявом їх культуральних властивостей.

Чашки ретельно розглядають і вивчають ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі досліджують колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. Структуру колоній дослі­джують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні чи волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.

Характеристика колоній – важлива складова частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії.

З підозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грама для вив­чен­ня морфологічних та тинкторіальних властивостей збудників, досліджують рухо­мість бактерій у “висячій” чи “надавленій” краплі. Ці ознаки мають надзвичайно велике діагностичне значення при характеристиці окремих видів мікроорганізмів.

Рештки досліджуваних колоній обережно, не торкаючись інших, знімають із поверхні середовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі із живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки або чашки з посівами поміщають у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватись стандартними сухими живильними середовищами, які випускає мікробіологічна промисловість. Такі середовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіологічних досліджень і стандартизувати їх.

На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному, хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.

Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в’язку, слизисту консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами.

У разі потреби виготовляється мазок, забарвлюється, досліджується під мікроскопом, а мікроорганізми засіваються петлею на поверхню щільного живильного середовища для одержання ізольованих колоній.

На третій день (ІІІ етап дослідження) вивчають характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію.

Спочатку звертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі та роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів та тинкторіальних (здатність фарбуватись) властивостей, роблять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже за зовнішнім виглядом та особливостями їх росту можна зробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфологічною ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральною ідентифікацією.

Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених мікробів. Тому досліджують біохімічні та серологічні властивості бактерій.

Реакція аглютинації на склі ­

Утворення аглютинату (пластівців) свідчить про гомологічність антигенів збудника та антитіл діагностичної сироватки, що дозволяє визначити вид інфекційного агента. При наявності позитивної орієнтовної реакції аглютинації її ставлять у розгорнутому варіанті (реакція аглютинації Грубера).

При деяких інфекційних захворюваннях (дифтерія) ідентифікацію проводять за токсигенними властивостями мікробів. Метод грунтується на визначенні токсигенної активності коринебактерій дифтерії за допомогою реакції преципітації. Утворення ліній преципітації між колоніями токсигенних штамів та папірцем, просоченим антитоксичною сироваткою, свідчить про позитивну реакцію.

Інколи ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи лабораторних тварин чистою культурою і спостерігаючи за тими змінами, які викликають збудники в організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз тощо). Такий метод називають ідентифікацією за біологічними властивостями. Як об’єкти – найчастіше використовують гвінейських свинок, білих мишей і щурів.

Дуже важливим при виділенні мікроорганізмів є визначення їх чутливості до антибіотиків з метою вибору оптимального препарату для лікування. Найчастіше користуються методом стандартних дисків (метод дифузії в агар, диско-дифузійний метод). Для цього на поверхню спеціального щільного живильного середовища в чашках Петрі засівають культуру мікроорганізмів і накладають паперові диски, просочені різними антибіотиками. Посіви інкубують при оптимальній температурі 18-24 год і вимірюють зони затримки росту бактерій навколо дисків з антибіотиками. За розмірами цих зон визначають належність бактерій до чутливих, помірно резистентних або стійких штамів.