Клональное микрорлзмножение растений
Клональное микроразмножение - получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру - принципиально новый метод вегетативного размножения. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.
Преимущества над традиционными способами размножения:
· получение генетически однородного посадочного материала;
· освобождение растений от вирусов;
· высокий коэффициент размножения. (Ю5.: Л0б - для травянистых, цветочных растений, 104..,105 ~ для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных);" '
· сокращение продолжительности селекционного процесса;
· ускорение перехода растений от ювекильной к репродуктивной фазе развития;
· размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
· возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала:
· возможность автоматизации процесса выращивания.
Методы размножения растений
Процесс клонального микроразмножения разделяют на четыре этапа:
1. выбор растения - донора, изолирование зкеняантов и получение хорошо растущий стерильной культуры;
2. собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества микропобегов;
3. укоренение размноженных побегов и приспособление-их к почвенным условиям;
4. выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.
Исходя из предложенных в литературе методов микроразмножения растений этот процесс можно осуществлять следующими; методами:
- активизацией развития уже существующих в растении меристем;
- индукцией соматическою эмбриогенеза;
- дифференциацией адвентивных ночек в первичной и пересадочной каллусной ткани.
Первый метод используемый при клональном микроразмножении растений - это активация развитии уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями:
- удаление верхушечной меристемы стебля и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде;
- добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов.
Второй метод - это индукция возникновения адвентивных непосредственно тканями зкспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения. Образования адвентивных почек возможно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции.
Таким образом, от одного материнского растения можно получать несколько миллионов раетений-регенерантов в год.
Третий метод, практикуемый ври клональном микроразмножении, основывается на дифференциациииз соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматический эмбриогенез. Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня.
Четвертый метод клонального микроразмножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Практически он мало используется для получения посадочного материала in vitro, т.к. при периодическом пересаживании каллусной ткани часто наблюдаются нежелательные изменения плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетическими изменениями наблюдаются изменения и по морфологии: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоузлий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредителям
Однако данный метод имеет свои положительные стороны и преимущества. Во-первых, он эффективен и экономически выгодный, т.к. в процессе размножения из каждой индивидуальной каллусной клетки может сформироваться адвентивная почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным способом й размножения растений в культуре тканей. В-третьих - представляет большой интерес для селекционеров, т.к. растения полученные данным методом, отличаются генетически и морфологически друг от друга.
Питательные среды. Любая питательная среда включает в себя: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, аминокислоты, регуляторы роста гормональной природы.
Обязательным условием является присутствие в среде кроме элементов питания гормональных факторов или имитаторов их действия. Известно пять групп соединений, относящихся к категории фитогормонов. Это цитокинины, ауксины, гиббереллины, абсцизовая кислота и этилен. При in vitro было выявлено, что для превращения специализированной клетки в меристематическую, способную к делению, необходимо участие двух и более гормонов, относящихся к разным группам.
Условия культивирования. После тщательного перемешивания компонентов питательной среды регулируется рН всей смеси путем добавления 0,1 N NaOH и 0,1 N НС1.
Факторы окружающей среды, такие как свет, температура и состав воздуха, влияют на рост и развитие клеток в культуре органов и тканей. Действие этих факторов взаимосвязано.
Процесс микроразмножения растений состоит из трех этапов:
- эксплантирование исходного материала,
- собственно микроразмножение,
- укоренение размноженных побегов.
При получении посадочного материала древесных растений методом микроклонирования можно выделить и четвертый этап
- адаптации регенерантов к нестерильным условиям среды .
Отбор экстантов и введение их в культуру. Для микроразмножения древесных растений используют два основных типа исходного материала:
- ювенильный (семена и их отдельные части, а также части проростков);
- молодые ткани взрослых растений (почки, хвоя, ткани листа, побеги).
Перед введением в культуру материал стерилизуют. Стерилизующие растворы могут быть разделены на несколько групп. Первая из них включает растворы, содержащие активный хлор: хлорамин, хлорная известь, гипохлорит кальция и гипохлорит натрия. Вторая группа включает ртутьсодержащие растворы, обладающие наибольшим дезинфицирующим эффектом: хлорид ртути и диацид. Растворы второй группы используют в тех случаях, когда препараты первой группы оказались неэффективными.
Перед высадкой на питательную среду материал ополаскивают в стерильной воде.
Мультипликация побегов. При правильно подобранной питательной среде, надежной стерилизации и подходящих условиях культивирования в пробирке или колбе образуется несколько побегов. Часть из них пересаживают на новую среду для образования корней, а другую повторно культивируют для увеличения количества побегов. Этот процесс повторяют многократно до получения требуемого количества посадочного материала.
Ризогенез. Питательная среда для культивирования побегов с целью образования на них корней отличается от среды, которая использовалась на первом этапе. Для многих растений необходимо использовать среду с низким содержанием солей. Время, необходимое для формирование корней, варьирует от 10 до 15 дней. Растения из пробирки пересаживают, когда корни достигнут 5 мм длины. Более длинные корни могут при пересадке поломаться.
Адаптация к нестерильным условиям среды. Для переноса растений из культуральных сосудов в почву требуется особая осторожность. Корни промываются для удаления налипшей на них питательной среды. Первые 10-15 дней в теплице поддерживается высокая влажность (90-100%).
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям наиболее дорогостоящая и трудоемкая операция. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Это связано во первых с тем, что у растений нарушается деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, из-за этого, нарушается поглощение воды и минеральных солей из почвы. Поэтому на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применяется искусственная микоризация растений (для микотрофных), учитывая положительную их роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов. Существует два способа заражения растений микоризообразующими грибами, in vitro (в стерильных условиях); in vivo (в естественных условиях). Первый способ более благоприятен, так как в этом случае исключается возможность загрязнений почвы, другими микроорганизмами.
Оздоровление посадочного материала
Преимущество клонального микроразмножения - это получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Это возможно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордий) и является свободной от инфекции.
Строение точки роста растений имеет свою специфику: дистальная её часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр до 200 мкм, высота от 20 до 150 мкм. В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения.
Применение электронной микроскопии часто обнаруживает наличие вирусов в меристеме пораженных ими растений что, подтверждает что количество лишенных вируса растений после подобной операции чрезвычайно мало и многие меристемы пораженных растений инфекционны.
Таким образом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений оказывается низкой.
В принципе возможно получение безвирусной апикальной меристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани должен быть снижен до нуля. Это может быть достигнуто путем применения предварительной термотерапии исходных растений или хемотерапии.
Метод термотерапии применяется как в условиях in vitvo, так in vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха.
Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где в течение первой недели повышают температуру от 25 до 37°С путем ежедневного увеличения параметров температур на 2°С. Важно при термотерапии создавать и поддерживать оптимальные режимы: температуру 37°С, освещенность лампами дневного света 5 тыс. лк, фотопериод 14...16 ч в сутки при относительной влажности воздуха в термокамере 90%. Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости.
Другой способ, применяемый для освобождения растений от вирусов, - хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина - 1в ...-Д-рибофуранозил - 1, 2, 4 - триазол-З-карбоксимид (коммерческое название вирозол) концентрацией 20...50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. При его использовании в культуральной среде процент безвирусных меристемных растений для ряда обычных для этих растений вирусов увеличивался до 80... 100% при 0...41% в контроле.
Возраст исследуемого материала.Возраст первичного экспланта существенно влияет и на укоренение микропобегов, размноженных in vitro. С увеличением возраста исходного материала, как правило, снижается способность побегов к укоренению.
Несомненно, с практической точки зрения целесообразно размножать растения, и в частности древесные, в возрасте старше 20 лет. Однако размножение их in vitro в таком возрасте представляет большие трудности. Во-первых, все типы тканей и органов у взрослых растений эндогенно заражены грибами и бактериями, что значительно затрудняет получение асептической культуры. Во-вторых, почки или другие органы одного и того же взрослого дерева различаются между собой по поведению в условиях in vitro гораздо больше, чем это имеет место у травянистых растений, что приводит к проведению специальных экспериментов по подбору оптимальных условий культивирования, обеспечивающих нормальный рост и развитие вновь введенных эксплантов в культуру.
В настоящее время преодоление возрастного барьера осуществляется путем реювенилизации - сочетание работ in vivo и in vitro. Реювенилизацию (омоложение) можно проводить несколькими путями:
- многократной обработкой растущего дерева или отдельных ветвей раствором цитокинина перед эксплантированием;
- повторным черенкованием;
- частой подрезкой деревьев для индукции роста побегов непосредственно из ствола дерева или для стимуляции корневых отпрысков;
- проведением повторных прививок;
- путем серии субкультивирований (in vitro);
- созданием густых насаждений, обеспечивающих боковое затенение, которое будет стимулировать развитие спящих почек.
Итог
Клональное микроразмножение растений является новым перспективным способом вегетативного размножения, позволяющим получать генетически однородный, оздоровленный посадочный материал, иметь высокий кооффициент размножения, сокращать селекционный процесс, проводить работы в течение года, экономя при этом площади, необходимые для выращивания растений. Во многих странах мира биоиндустрия микроклонального размножения поставлена на поточную промышленную основу и представлена десятками активно функционирующих предприятий. В настоящее время многие научно-следовательские институты и промышленные лаборатории разрабатывают и усовершенствуют методы микроразмножения и оздоровления различных декоративных, плодовых, ягодных, овощных, кормовых и древесных культур.