Способы хранения и транспортировки икры и спермы
Способность икры и спермы до оплодотворения сохранять свои качества при определённых условиях имеет большое значение для рыбоводства. В рыбоводной практике бывает необходимо сохранять икру и сперму до осеменения. Это связано с тем, что при наличии самок со зрелой икрой могут отсутствовать самцы со зрелой спермой и наоборот. Иногда икру получают на рыбоводных пунктах, а осеменяют на РЗ, что связано с обеспечением более квалифицированного осеменения.
Ещё В.П. Врасский наблюдал, что сперма ерша и окуня в стерильных условиях в сухом сосуде в течение б ч сохраняет активность при комнатной температуре. Хорошо сохраняется сперма в сухих пробирках на холоде. При этом сперму от разных самцов следует хранить в отдельных пробирках (в одной пробирке сперматозоиды от разных самцов гибнут значительно быстрей).
Чем лучше качество спермы и чем ниже температура, тем дольше сохраняется её активность. Сперма сазана сохраняет способность оплодотворять икру в течение 5-6 суток при температуре от 0 до 2° и в течение 2 суток при температуре от 2 до 5°С. У форели сперма сохраняет способность оплодотворять икру в течение 6 суток при температуре 0°, в течение 3 суток — от 5 до 6 °С. У лососей сперма сохраняется в течение 2-3 суток при температуре 2°, а у осетровых — до 10-12 суток при температуре 4°С.
Для непродолжительного хранения спермы (в течение нескольких суток) используют сухие чистые пробирки, помещённые в термос сольдом или бытовые холодильники. Сперму рыб, помещённую в сухие стерильные пробирки, установленные в термос со льдом, можно перевозить на любые расстояния.
Икру, как правило не хранят, поскольку её качество быстро падает. Допускается хранение овулировавшей икры в прохладном месте в овариальной жидкости без воды, так как способность икры к оплодотворению сохраняется в ней значительно дольше, чем в воде и других средах. Нужно помнить, что при длительном хранении (более 30 минут) оплодотворяемость икры снижается за счёт её активации, то есть начавшегося партеногенетического развития.
Криоконсервация спермы рыб. Для более длительного сохранения спермы может быть использована её криоконсервация. Криоконсервация – это сложный физико-химический процесс, включающий несколько этапов: получение и отбор образцов спермы, предварительное охлаждение (до +5–0°С), смешивание с защитным раствором, разделение на порции (контейнеры или гранулы), программное охлаждение, хранение в жидком азоте (- 196°С), отогрев, использование для осеменения.
Защитный раствор содержит ионно-осмотическую основу (по составу близкую к плазме), буфер (обычно трис-гидрохлорид или цитрат) в 0,05-0,1 М концентрации и криопротектор (от лат protector – покровитель) — глицерол, диметилсульфоксид, диэтилсульфоксид, метанол, иногда этиленгликоль. Разработаны методы криоконсервации и размораживания более 200 видов пресноводных и морских рыб, а также других гидробионтов.
Для автоматизации процесса охлаждения и хранения спермы используется устройство охлаждения программное (УОП), которое предназначено для низкотемпературного консервирования различных биологических материалов.
Общепризнано, что наибольших успехов в криоконсервации спермиев рыб достигли российские учёные. Осеменение икры размороженной спермой даёт хорошие результаты – количество развивающихся эмбрионов у лососевых рыб достигает 90%, у осетровых и карпа – 75%.
Попытки глубокого замораживания ооцитов и эмбрионов рыб пока не увенчались успехом в отличие от замораживания яйцеклеток млекопитающих и человека.
Глава 6.
Биологическое обеспечение условий инкубации икры, выдерживания
предличинок, подращивания личинок и выращивания молоди рыб
6.1. Биологические основы подготовки икры к инкубации
Перед тем, как поместить оплодотворённую икру в инкубационные аппараты, её тщательно отмывают от остатков спермы, слизи, полостной жидкости и при необходимости ликвидируют её клейкость — обесклеивают.
Оплодотворённая и неоплодотворённая икра, попадая в воду, интенсивно набухает. Вода проникает под оболочку, растягивает её и отделяет от желтка. Образующееся перивителлиновое пространство заполняется водой с небольшим количеством белка. Объём оплодотворённой икры увеличивается более чем на 20%. Во время набухания происходит не только поглощение воды икринкой, но и изменение структуры отдельных частей икринки, главным образом её оболочек. У тех видов рыб, в состав яйцевых оболочек которых входит хорион (литофилы, фитофилы, некоторые остракофилы и индифферентные), одновременно происходит его обводнение, увеличение толщины и появляется клейкость икринки.
Потребление воды, идущей на образование перивителлиновой жидкости икринок, прекращается с увеличением прочности оболочек. После оплодотворения прочность оболочек быстро возрастает. Например, неоплодотворённая икринка севрюги выдерживает груз 15-20 г (при большей нагрузке разрывается). Через 15 минут после оплодотворения она уже выдерживает груз в 2 раза, а через один час в 3-4 раза больше. Это необходимо учитывать при отмывке икры.
В искусственных условиях инкубация икры одних рыб проводится в соответствии с характером развития в естественных условиях, других — в условиях, отличных от естественных Так, например, икра осетровых и сиговых, развивающаяся в природе в прикреплённомсостоянии, в искусственных условиях инкубируется соответственно в периодически взвешенном и взвешенном состояниях. В этом случае клейкость икры, необходимая ей в естественных условиях, становится помехой при инкубации. Чтобы икра не склеивалась в комки и не погибала, её отмывают от клейкости — обескленвают. Отмывку проводят или просто водой, или водой с добавлением обесклеивающих веществ, дубящих (таннин) или «опудривающих» (инкрустирующих) (тонкий речной ил без примеси песка, тальк, молоко) клейкую оболочку в самом начале её гидратации, что предотвращает склеивание икринок между собой. Икру осетровых, карповых, европейского сома и других с целью снижения её гибели от слипания икринок в комки инкубируют во взвешенном или периодически взвешенном состоянии, избавляясь от клейкости с помощью ферментов, таких как гиалуронидаза, трипсин, проназа, препарат ПАС-Г.
Раньше при заводском методе получения потомства у карповых рыб использовали смесь дубящих органических веществ танин. Позже от него отказались, поскольку он вызывает значительное увеличение прочности оболочек, что усложняет вылупление предличинок. Обесклеивание икры речным илом как наиболее доступный, не требующий материальных затрат, способ широко применяли в осетроводстве и карповодстве. Привлекала возможность взятия ила из близлежащих водоёмов. Ил разводили водой и процеживали через двойной слой марли. Густота смеси ила с водой (суспензии) должна быть такой, чтобы сразу после добавления её к икре каждая икринка находилась во взвешенном состоянии. При обесклеивании илом, входящие вею состав минеральные и органические частицы приклеиваются к оболочке икринок, предотвращая их склеивание между собой, однако при этом сильно увеличивают удельный вес икринок, также расход воды для их перемешивания в аппаратах по обесклеиванию икры или в инкубационных аппаратах. Но самое главное частицы ила травмируют плавниковую складку предличинок, вылупившихся из оболочек. Во избежание этого для обесклеивания икры стали применять тальк — минеральное неорганическое вещество, представляющее собой водный силикат магния (Mg3[Si4O10](OH2) в виде тонких кристаллов чешуеобразной или листовидной формы. Тальк, как и ил, «опудривает» икринки, однако не образует густого слоя на их поверхности, а впоследствии его частички постепенно отклеиваются от яйцевой оболочки. Кроме того, использование талька в качестве обесклеивающего вещества, затрудняет развитие на оболочке сапролегнии, что выгодно отличает его от ПАС-Г или семенниковой жидкости, применяемых для обесклеивания икры рыб.
При ферментативных способах обесклеивания икры применяют промышленную гиалуронидазу как фермент, составляющий основу желёз вылупления у рыб и истончающий яйцевую оболочку икринки путём гидролиза её химических компонентов. Действие этого же фермента положено в основу обесклеивания с помощью суспензии фарша свежих семенников домашних животных и рыб, а также получаемого из них сухого порошка под названием ПАС-Г (порошкообразные ацетонированные семенники — «говяжьи»). Из этого препарата готовят маточный раствор: 5 г препарата настаивают при комнатной температуре не менее 3 ч в 10 мл стерильного физиологического раствора. Маточный раствор ПАС-Г можно хранить в холодильнике 5-7 суток. Для обесклеивания его разбавляют водой в 10 раз.
Для растворения клейкой части яйцевой оболочки используют 1%-й раствор трипсина, приготовленный на фосфатном буфере с рН = 7,4-7,5. Икру выдерживают в нём несколько минут до потери клейкости и промывают водой. Можно для этих же целей применять 1%-й раствор проназы.
Наиболее эффективным и доступным считается способ обесклеивания с помощью натурального или сухого молока. При этом молоко разбавляют водой в 10-20 раз. Этот способ широко применяется в нашей стране и за рубежом при разведении осетровых, карповых, сиговых рыб, а также буффало и сома.
Для ускорения процесса обесклеивания можно применять смещение рН воды в кислую сторону до 5,5-6,0 с помощью уксусной кислоты (6 мл на 1 л).
Для обесклеивания икры осетровых, сиговых и частиковых рыб применяют аппарат обесклеивания икры — АОИ (рис 49). Он состоит из 5 сосудов (объёмом 11 л каждый), смонтированных на трубчатой раме. Обесклеивание осуществляется барботированием обесклеиваюшей жидкости и икры при помощи подаваемого снизу воздуха.
Икра лососевых рыб, обладающая слабой клейкостью, обычно отмывается просто речной водой в течение нескольких минут.
Отмывка икры (главным образом, осетровых) от клейкости вызывала дискуссии. Некоторые исследователи (Садов, Емельянов) считали, что применяемое обесклеивание икры осетра и севрюги замедляет эмбриональное развитие, повышает гибель эмбрионов, особенно в период вылупления; что личинки менее жизнеспособны, чем личинки из необесклеенной икры.
На основании такой точки зренияпредлагалось инкубировать икру осетровых в условиях близких к естественным, то есть в прикреплённом состоянии (Садов). Для этого был сконструирован лоточный инкубационный аппарат Садова-Коханской. Однако ещё в 1925 г А.В. Подлесный доказал, что отход при инкубации зависит от осторожности промывания. Наблюдения Л.А. Алявдиной показали, что икра осетровых рыб в естественных условиях также теряет клейкость, инкрустируясь частицами ила и песка.
Позже опытным путём было доказано (Зырянова), что инкубация икры, приклеенной к субстрату, не имеет преимуществ по сравнению с инкубацией предварительно обесклеенной икры. Главное осторожно производить отмывку. Грубая отмывка приводит к большому отходу и увеличению процента уродливых форм. Позже исследования М.Ф. Вернидуб, Б.Н. Казанского подтвердили возможность применения метода инкубации обесклеенной икры в практике искусственного воспроизводства рыб.
Обычно икру лососевых после оплодотворения оставляли для набухания на 5-6 ч. Специальными исследованиями доказано, что время необходимое для набухания икры, является значительно меньшим и равно 1-1,5 ч. Например, длительность набухания икры у кижуча 70-75 минут, у кеты, горбуши менее одного часа (40-60 минут), у нерки, лосося 50-60 минут. У сига время набухания несколько больше — 120-140 минут.
Во время набухания икры при отсутствии проточности воду в тазах с икрой необходимо менять через каждые 20-30 минут.