Определение активности амилаз в прорастающих
Зерновках злаковых культур
Амилазы – однокомпонентные ферменты, которые катализируют гид-ролитическое расщепление a(1®4)-связей в молекулах крахмала. У растений они представлены большими наборами изоферментов. К амилазам относятся a-амилаза (3.2.1.1), b-амилаза (3.2.1.2), глюкоамилаза (3.2.1.3).
a-Амилазы действуют на a(1®4)-связи в молекулах крахмала и рас-щепляяют их на более мелкие фрагменты, представляющие собой низкомоле-кулярные полисахариды – декстрины. В молекулах амилопектина эти фер-менты подвергают гидролизу a(1®4)-связи между точками ветвления полисахаридной цепи, поэтому без их участия невозможно полное гидролитическое расщепление амилопектина. Для проявления каталитичес-кой активности a-амилаз необходимо присутствие в реакционной среде хлорид-ионов, которые служат активаторами фермента.
Под действием b-амилаз происходит гидролитическое расщепление a(1®4)-связей на концах полисахаридных цепей целых молекул или декстринов с образованием мальтозы. Действие этих ферментов прекраща-ется при достижении точек ветвления молекул крахмала, в которых глюкозные остатки соединены a(1®6)-связями.
Глюкоамилазы так же, как и b-амилазы, катализируют гидролиз a(1® 4)-связей на концах полисахаридных цепей, но в результате действия этих ферментов от концов полисахаридных цепей отщепляются молекулы глю-козы. Глюкоамилазы в наибольшем количестве содержатся в биологических источниках микробного происхождения и меньше их синтезируется в растительных продуктах.
Препараты, содержащие амилолитические ферменты, используются в производстве хлеба, пива, пищевого спирта, а также в качестве кормовых добавок в животноводстве для улучшения перевариваемости пищеваритель-ной системой животных крахмала, содержащегося в кормах.
Особенно высокая активность амилаз наблюдается при прорастании семян, клубней и луковиц, когда в них происходит интенсивный распад полисахаридов крахмала и увеличивается концентрация декстринов, мальтозы и глюкозы, используемых для формирования тканей проростков. Высокая активность амилаз характерна для солода, который получают путём высушивания проросшего зерна злаковых культур.
При повышении активности амилаз в продовольственном зерне, используемом для производства хлеба, макарон и крупы, ухудшаются его технологические свойства. В хлебопекарном тесте амилазы осахаривают крахмал, обеспечивая субстратами процесс брожения и образования диоксида углерода для разрыхления теста, формирования пористости хлебного мякиша. Повышенная амилазная активность в тесте (особенно a-амилаз) инициирует чрезмерное газообразование и превращение крахмала в декстрины, что ухудшает свойства хлебного мякиша (заминаемость, солодовый привкус).
При изучении амилолитических ферментов зерна пшеницы выяснено, что активность a-амилаз в зерновках возрастает при усилении азотного питания растений. Под действием азотных удобрений в зерновках пшеницы снижается концентрация водорастворимых белков, в составе которых содержатся белки, являющиеся ингибиторами амилаз. В связи с этим меньше ферментных белков связывается ингибиторами в неактивные комплексы и больше остаётся каталитически активных свободных форм a-амилаз.
Исследования состава ферментных белков зерна показали, что повышение активности a-амилаз в зрелых зерновках пшеницы, вызванное внесением азотных удобрений, при относительно сухой погоде в период их созревания обусловлено a-амилазами «созревания», которые не полностью переходят в связанную форму. Высокий уровень a-амилазной активности в зерновках, сформировавшихся во влажных условиях, в значительной степени
связан с ферментными белками, которые синтезируются в результате начавшегося процесса прорастания зерна.
Принцип метода.Выделенный из растительной пробы ферментный экстракт, содержащий α и β-амилазы, добавляют в раствор крахмала с заданным значением рН и в течение определённого времени смесь выдерживают при оптимальной температуре. Затем ферментативную реакцию останавливают путём инактивации амилаз и оставшийся не- гидролизованный крахмал определяют колориметрически по реакции с йодом, который даёт с крахмалом сине-фиолетовое окрашивание. Общее количество крахмала в растворе определяют также колориметрически после проведения реакции с ферментной пробой, которая подвергается инактивации перед добавлением её к раствору крахмала; или вместо ферментной пробы в инкубируемую смесь добавляют такой же объём растворителя, который используется для экстракции ферментных белков. По разнице результатов, полученных в реакциях с инактивированными и активными ферментами, вычисляют суммарную активность α и β-амилаз, выделенных из растительной пробы.
Активность α-амилаз, содержащихся в ферментном экстракте, определяют с помощью указанных выше реакций после тепловой инактивации β-амилаз, которые подвергаются денатурации при температуре 70°С, тогда как α-амилазы в данных условиях полностью сохраняют свою каталитическую активность. Активность β-амилаз рассчитывают при вычитании из суммарной амилазной активности показателя активности α-амилаз. Учитывая, что активаторами амилаз служат хлорид-ионы, для экстракции этих ферментов из растительной пробы используется раствор хлористого натрия.
Оборудование.Фарфоровые ступки с пестиками диаметром 8-10 см или гомогенизатор; лабораторные весы; марля для фильтрования;фарфоровые чашки диаметром 6-8 см; терморегулируемая водяная баня; термостат; дозирующие пипетки на 1-10 мл; мерные колбы с пробками на 50, 200 и 1000 мл; капельница для раствора йода; штатив с пробирками на 20 мл; фотоэлектроколориметр с набором кювет, тёмная склянка для хранения йодного реактива.
Реактивы.Хлористый натрий; водорастворимый крахмал; йодистый калий; кристаллический йод; концентрированная уксусная кислота, гидрок-сид натрия, дистиллированная вода; концентрированная соляная кислота; уксуснокислый кальций.
Приготовление растворов.1% раствор хлористого натрия: в мерной колбе на 1 л растворяют 10 г химически чистого хлористого натрия.
0,2 М ацетатный буферный раствор (рН=5,5): 27,22 г ацетата натрия (СН₃СООNa∙3H₂O) растворяют в 1 л дистиллированной воды; 2,3 мл концентрированной уксусной кислоты (1,05 г/см³) растворяют в 200 мл дистиллированной воды; затем смешивают 885 мл раствора уксуснокислого натрия и 115 мл раствора уксусной кислоты.
2% раствор крахмала: в химическом стакане на 400 мл 4 г водорастворимого крахмала смешивают с 50 мл дистиллированной воды и к ним приливают 150 мл горячей воды (70-80°С), затем полученную смесь при помешивании нагревают на кипящей водяной бане до полного растворения крахмала. Охлаждённый раствор крахмала далее используют для определе-ния активности амилаз.
1 М раствор соляной кислоты: 41,16 мл концентрированной соляной кислоты (1,19 г/см³) растворяют в 200 мл дистиллированной воды и после охлаждения полученный раствор переливают в мерную колбу на 500 мл, объём раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.
0,1 М раствор соляной кислоты: 50 мл 1 М раствора соляной кислоты разбавляют дистиллированной водой в мерной колбе на 500 мл, доводят объём водой до метки и перемешивают.
0,3% раствор йода в 3% растворе йодистого калия: 0,3 г йода и 3 г йодистого калия при нагревании растворяют в 50 мл дистиллированной воды, полученный раствор после охлаждения количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят объём раствора в колбе до метки водой и перемешивают. Раствор хранят в тёмной склянке.
Ход определения.Навеску прорастающего зерна 1 г, взвешенную с точностью до 0,01 г, растирают в ступке с небольшим количеством кварцевого песка до получения однородной массы. К полученной смеси приливают 10 мл 1% раствора хлористого натрия и содержимое ступки интенсивно перемешивают в течение 15 минут. Затем смесь из ступки переносят на марлевую ткань, уложенную в 4 слоя на фарфоровую чашку, и отжимают растительный экстракт, содержащий амилолитические ферменты, в чашку.
Примерно половину ферментного раствора дозирующей пипеткой переносят из чашки в пробирку, добавляют несколько кристалликов уксуснокислого кальция для стабилизации α-амилаз и помещают на 15 минут в водяную баню, в которой поддерживается температура 70°С. При такой температуре происходит тепловая денатурация β-амилаз. После отстаивания прозрачный ферментный раствор из пробирки, содержащий активные α-амилазы, используют для дальнейшего анализа.
На следующем этапе в 3 стеклянные пробирки на 20 мл дозирующей пипеткой приливают по 3 мл ацетатного буферного раствора (рН=5,5) и 2% раствора крахмала, содержимое пробирок перемешивают и 5 минут выдер-живают в термостате при температуре 40°С. Затем в одну из пробирок приливают 1 мл ферментного экстракта с активными α и β-амилазами, в другую пробирку 1 мл ферментного экстракта с активными α-амилазами (после инактивации β-амилаз), а в третью пробирку – 1 мл 1% раствора хлористого натрия, содержимое пробирок перемешивают и все пробирки помещают на 10 минут в термостат, в котором поддерживается температура 40°С. Когда в пробирки приливают активные ферментные экстракты, фиксируют точное время начала реакции. По истечении 15 минут в указанные пробирки приливают по 2 мл 1 М раствора соляной кислоты, содержимое пробирок перемешивают и фиксируют точное время прекращения ферментативной реакции (в кислой среде происходит инактивация амилаз).
Оставшийся в пробирках негидролизованный крахмал определяется окрашиванием с использованием йодного реактива. Для этого из каждой пробирки отбирают пробы по 0,5 мл и вносят их в мерные колбы на 50 мл, в которые предварительно наливают по 40-45 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,1 М раствора соляной кислоты. Содержимое колб перемешивают, доводят объём до метки водой, снова перемешивают. Затем в колбы добавляют из капельницы по 3 капли раствора йода в растворе йодистого калия и содержимое колб перемешивают. Окрашенные растворы колориметрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 595 нм, используя кюветы с толщиной фотометрируемого слоя 1 см.
Обработка и оценка результатов.Суммарную активность амилолити-ческих ферментов рассчитывают по формуле:
(D₃ – D₁) · 60 ∙ 10
Аά + β = ¾¾¾¾¾¾¾¾¾ ,
D₃ ∙ 1 ∙ t
где Аά + β – суммарная активность амилаз в мг гидролизованного крахмала за
1 мин в расчёте на 1 г растительной массы;
D₃ – показание фотоэлектроколориметра при определении оптической плотности окрашенного раствора в варианте без добавления к раствору крахмала ферментного экстракта (добавляли 1% раствор хлористого натрия);
D₁ – показание фотоэлектроколориметра при определении оптической плотности окрашенного раствора в варианте с добавлением к раствору крахмала ферментного экстракта, содержавшего активные α и β-амилазы;
60 – количество крахмала в 3 мл 2% раствора, мг;
10 – общий объём ферментного экстракта, полученного из навески расти-тельного материала, мл;
1 – объём ферментного экстракта, взятый для проведения фермента-тивной реакции гидролиза крахмала, мл;
t – время ферментативной реакции в минутах.
Активность ά-амилаз определяют по указанной выше формуле, в которой D₁ заменяют на D₂ (показание фотоэлектроколориметра при определении оптической плотности окрашенного раствора в варианте с добавлением к раствору крахмала ферментного экстракта с активными ά-амилазами). Активность β-амилаз рассчитывают по разности между суммарной амилазной активностью и активностью ά-амилаз.
Если в вариантах с добавлением активных ферментов весь крахмал за время реакции гидролизуется, то при добавлении йодного реактива не образуется синего окрашивания. В этом случае определение активности амилаз нужно повторить, но при этом необходимо уменьшить время ферментативной реакции.
После выполнения работы сравнить показатели активности амилолитических ферментов в растительных пробах, которые получены из прорастающих семян разных злаковых культур с различными сроками проращивания (1. 2, 3 суток и т. д.).
Контрольные вопросы
1. Как действуют α-амилазы, β-амилазы и глюкоамилазы на крахмал?
2. Какое значение имеют амилазы при оценке качества зерна?
3. Как применяются ферментные препараты амилаз в пищевой переработке?
4. Почему ухудшаются технологические свойства зерна при повышении активности α-амилаз?
5. Под действием каких факторов повышается активность амилаз в зерне?
6. В чём состоят особенности определения активности амилаз с использованием йодного реактива?
7. Как удаётся определить активность α и β-амилаз?
8. Какова методика выделения амилаз из растительной пробы?
9. Как проводится ферментная реакция амилаз с раствором крахмала?
10. Как получают окрашенный раствор негидролизованного крахмала после проведения реакции с амилазами?
11. Каковы принципы расчёта суммарной амилазной активности и активности α и β-амилаз?
12. Как изменяется активность амилаз при прорастании зерновок злаковых культур?
13. Какова активность амилаз в зрелом зерне, сформировавшемся при сухой и влажной погоде?