Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция была открыта в 1984 году, американским ученым Кэрри Мюллисом, который впервые показал возможность амплификации (многократного увеличения числа копий) участков ДНК в пробирке, в процессе реакции, главной особенностью которой являются повторяющиеся температурные циклы.

В 1985 году были показаны практические возможности применения ПЦР. Начиная с 1988 году, ПЦР с использованием термостабильной ДНК-полимеразы, получила широкое распространение. Уже в 1989 г. журнал «Science» назвал ДНК-полимеразу молекулой года. Однако мало кто знает, что в 1980 г. термостабильная ДНК-полимераза была выделена в России Городецким.

Метод ПЦР позволяет определять малые и сверхмалые количества нуклеиновых кислот, следовательно, ПЦР поднимает лабораторную диагностику на принципиально новый уровень – уровень прямого обнаружения инфекционного агента как вирусной, так и бактериальной природы. Методом ПЦР можно определить любое изменение в генетическом материале, в том числе и единичную мутацию.

1980 – В России выделена термостабильная ДНК-полимераза (Городецкий)

1984 – Mullis (США) предложил принцип амплификации ДНК

1985 – Saiki Saiki с соавторами (США) впервые амплифицировали фрагмент ДНК (β-глобиновый ген) с использованием термочувствительной ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова)

1987 – Mullis и Falloona амплифицировали ДНК человека

1988 – ПЦР стали проводить с использованием термостабильной ДНК-полимеразы

Внедрение метода ПЦР в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в медицине и молекулярной биологии в последнее десятилетие.

Области применения ПЦР

Ведущие фирмы мира уделяют огромное внимание развитию методов ПЦР-диагностики. В настоящее время ПЦР широко используется в ветеринарии для диагностики инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы, а также для получения рекомбинантных вакцин. Мы приводим неполный перечень тех областей, в которых используют ПЦР:

· Молекулярная биология

· Медицина

· Ветеринария

· Судебно-медицинская экспертиза

· Палеонтология

· Пищевая промышленность

· Контроль состояния окружающей среды

Принцип лабораторной диагностики при помощи ПЦР

Необходимым этапом является взятие проб для анализа у различных животных, в зависимости от заболевания. Первым шагом является выделение нуклеиновых кислот (ДНК или РНК). ДНК и РНК можно выделять из различных биологических образцов (крови, мочи, мокроты, костной ткани, биопсийного материала и даже из одиночного волоса). С помощью двух специфических праймеров – зондов и фермента (фрагмента Кленова) количество фрагмента-мишени (выбранного участка ДНК) можно увеличить в миллионы раз. С помощью метода ПЦР можно определять как ДНК- , так и РНК- содержащие вирусы, в исследуемых образцах. При детекции РНК, перед проведением ПЦР, должна быть проведена реакция обратной транскрипции (синтез ДНК- копии на основе выделенной РНК). Последним шагом является учет продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это серия повторяющихся циклов полимеразной реакции in vitro (в пробирке), т.е. увеличение числа копий определенного участка ДНК, контролируемое человеком.

ПЦР состоит из следующих стадий:

· Денатурации 94-95ºС (переход двухцепочечной формы ДНК в одноцепочечную форму, под действием высокой температуры)

· Отжига(гибридизации) праймеров 50-60ºС(одноцепочечные участки ДНК и праймеров, комплиментарные друг другу, «отжигаются», т.е. образуют двухцепочечную форму ДНК.)

· Полимеризации или элонгации (удлинение) цепи ДНК 72ºС(термостабильная ДНК-полимераза, или фрагмент Кленова, начинает синтезировать (достраивать) вторую цепочку по принципу комплементарности ДНК)

Для детекции продуктов ПЦР используется электрофорез, как самый простой. Дешевый и доступный метод на сегодняшний день. Электрофорез проводится в агарозном геле, содержащим бромистый этидий (агент связывающийся с нуклеиновыми кислотами и светящийся под действием ультрафиолетового света). Под действием электрического тока молекулы ДНК движутся от отрицательного полюса к положительному, при этом молекулы ДНК разной величины движутся с разной скоростью: короткие фрагменты за одно и тоже время походят большее расстояние от старта, чем длинные. После просматривания геля в ультрафиолетовом свете можно говорить о результатах ПЦР ( в случае успешного проведения ПЦР на геле видны светящиеся полоски).

Преимущества метода ПЦР

· Чувствительность достигает 10^-15 г, (что составляет несколько копий инфекционного агента на пробу объемом 0,2 мл)

· Специфичность

· Возможность диагностики латентных вирусных инфекций

· Возможность обнаружения агрегированного возбудителя

· Возможность дифференциации видов возбудителей

· Возможность быстрого выявления возбудителя

ПАТОМОРФОЛОГИЯ.

13.1. Цитологическое исследование (Код 801, 802)

Исследование в Лаборатории «Шанс Био» - 1 – 3 дня.

Исследуемый материал:

1. Пунктаты любых опухолевидных образований и уплотнений любой локализации (внутренних органов, молочной, щитовидной, предстательной железы, слюнных желез, лимфатических узлов, костей, мягких тканей, яичек, кожи и др.), в т.ч. под контролем ультразвука и рентгеновского исследования, а также пунктаты костного мозга, серозных полостей.

2. Материал, полученный при эндоскопии (ларинго-, трахео-, бронхо-, эзофаго-, гастро-, доудено-, колоно-, ректо-, цисто-, лапароскопии и др.), в т.ч. с помощью соскоба, отпечатка, аспирации, смыва, интраэндоскопической пункции.

3. Эксфолиативный материал (транссудаты, экссудаты, секреты, экскреты, в т.ч. моча, мокрота, выделения из сосков молочных желез, сок предстательной железы, мазки, соскобы, отпечатки, смывы из экто- и эндоцервикса, любых образований, изъязвлений, язв, свищей, ран кожи, слизистых оболочек и др.)

4. Материал, полученный интраоперационно или во время любого срочного исследования (в т.ч. при ультразвуковом исследовании, эндоскопии и др.), включая соскобы, отпечатки, пунктаты.

Взятие: Выбор способа взятия материала определяется характером поражения, локализацией, возможностью проведения инструментальных исследований. Желательно использование в комплексе всех доступных методов взятия материала.

В частности, при поражениях мочевого пузыря для цитологического исследования может быть использована нативная моча (эффективность цитологической диагностики 40-45%), спиртовой смыв (эффективность цитологической диагностики 60-65%), мазки-отпечатки с кусочков опухоли, взятых при цистоскопии (эффективность цитологической диагностики около 90%). При комплексном обследовании эффективность цитологической диагностики составляет около 100%.

Материал для цитологического исследования может быть получен различными способами. Прежде всего, это:

А. Эксфолиативная цитология, где анализу подвергаются:

отделяемое различных органов (молочная железа, бронхи и др.). Для приготовления препарата капля отделяемого наносится на стекло и готовится мазок. Можно также делать отпечатки с места выделения (сосок молочной железы, выходное отверстие свища). Отделяемое бронхов обычно в виде мокроты собирается в шприц путём пункции трахеи;
жидкости и содержимое кист получают путем пункции полостей (брюшной, плевральной и др.) и кист. Если материала мало, то он наносится на стёкла и распределяется в виде тонкого мазка. Значительные количества жидкости предварительно центрифугируются и затем мазки готовят из осадка. Таким же образом обрабатывается материал промывных вод;
отпечатки со слизистых и кожных покровов, если это доступно, можно делать непосредственно на стекло. В других случаях мазки готовят из соскобов шпателем, с тампонов.

Для исследования эксфолиативного материала в гинекологии существуют отработанные методики, описание которых — в соответствующем разделе.

Б. Пункционная цитология — один из наиболее частых видов исследования в клинической цитологии.

Пункция опухолевых образований производится, как правило, тонкой иглой. Для проведения аспирационной биопсии необходим определенный навык. Кроме того, для получения полноценного материала необходимо соблюдать ряд условий. В частности, игла и шприц для пункции должны быть сухими. Не следует проводить предварительную анестезию (введение новокаина). Для пункции богато васкулизированных образований (щитовидная железа, сосудистые опухоли, кость и др.), необходимо использовать иглу с мандреном, последний извлекается после введения иглы в место, из которых предполагается получить материал. Таким же образом, соблюдая вышеописанные правила и используя специальные приспособления, осуществляют пункции под контролем рентгена или ультразвука.

Тонкоигольная аспирационная биопсия. Материал берется с помощью шприца 10-20 мл с иглой 0,7-0,8. Игла вводится в толщу исследуемой ткани, фиксируется, как правило, левой рукой за канюлю, правой рукой откачиваете поршень шприца. Откачав, отсоединяете шприц от иглы, возвращаете поршень в исходное положение, подсоединяете к игле, и, снова, откачиваете поршень («высасывая» клеточный материал из ткани). И так, до появления капли крови (или клеточного материала) в канюле иглы. Далее, «выдуваете» шприцем из иглы набранный материал на стекло, делаете мазок. Мазок сушите на воздухе. О мазках. Удобней всего пользоваться специальными шпателями для растяжки мазков (имеются в наличии в лаборатории).

В. Использование для цитологического исследования мазков-отпечатков с биопсийного и операционного материала значительно повышает эффективность цитологической диагностики. Кроме того, морфологическое заключение может быть получено значительно раньше, чем гистологическое. Следует отметить исключительную ценность таких параллельных исследований (цитологических и гистологических) в возможности проведения цитогистологических сопоставлений, что в свою очередь существенно обогащает как один, так и другой метод.

Для приготовления препарата необходимо соскоб со среза биоптата или операционного материала распределить тонким мазком на стекле. Отпечатки со среза биоптата или кусочка оперативно удаленной ткани наносятся прикосновением поверхности среза к стеклу. Если отпечатки делают с ткани богатой кровью (печень, селезенка и др.), с поверхности среза необходимо снять кровь на фильтровальную бумагу (бумажное полотенце, салфетку), и лишь затем производить отпечатки на стекло.

Г. С развитием эндоскопической техники цитологическое исследование стало более доступным. В современных эндоскопических приборах имеются специальные приспособления для взятия материала на морфологическое исследование. При эндоскопии могут быть получены в частности;

мазки щеточкой,
промывные воды,
мазки тампоном,
мазки - отпечатки щипковых биопсий.

Выбор способа взятия материала определяется характером поражения, локализацией, возможностью проведения инструментальных исследований. Желательно использование в комплексе всех доступных методов взятия материала.

Эндоскопическое исследование:

а) бронхоскопия — мазки щеточкой, трансбронхиальные пунктаты, мазки из материала щипковых биопсий, промывные воды,

б) гастроскопия — мазки щеточкой, отпечатки с щипковых биопсий,

в) колоноскопия, ректоскопия — мазки с ватного тампона, щеточные мазки, отпечатки с биопсий,

г) цистоскопия — нативная моча, спиртовой смыв, отпечатки, с биопсийных кусочков.

д) ларингоскопия — мазки с участков поражения и отпечатки с кусочков,

е) кожа и слизистые оболочки — мазки соскобов с участков поражения, при опухоли — пункция тонкой иглой.

Цитологическому исследованию обязательно должны подвергаться пунктаты серозных полостей, кист, отделяемое из соскоба молочной железы и др.

Стекла для препаратов должны быть чистые, обезжиренные и сухие.

Техника приготовления мазков

Полученное количество материала не всегда определяет возможности диагностики, иногда очень малое количество материала является достаточным для постановки диагноза. Наличие большого количества крови часто является помехой. При её наличии мазки необходимо делать как можно скорее, иначе наступает свертывание и из свернувшегося сгустка очень трудно сделать мазки и провести исследование. Материал наносят на стекло и очень аккуратно делают мазки, т. к. клетки очень ранимы, а наличие большого количества разрушенных клеток мешает правильной диагностике.

Из жидких пунктатов мазки готовят подобно мазкам крови, если полученная масса плотная или комковатая, то помимо мазков можно приготовить и отпечатки на стекле.

Метод отпечатков имеет определенные преимущества.

Во-первых клетки подвергаются гораздо меньшему травматизму.

Во-вторых есть возможность расположения клеток пластами, что помогает при описании цитологического препарата характеризовать и соотношение клеток между собой.

В-третьих, если материал богат кровью, его необходимо нанести на стекло и тогда выбирать оттуда "белые крупинки" и ими делать мазки.

Метод отпечатков применим при использовании цитологического метода во время операционного вмешательства, а так же получении биопсии. Этот метод может быть использован как самостоятельно, так и параллельно с гистологическим анализом.

В этих случаях помимо пункций проводят получение отпечатков с удаленных или обнаженных органов, с помощью прикосновения стекла предметного к исследуемой ткани. Так же можно готовить препараты при получении материала методом соскоба.

Жидкости, полученные при пункции, тут же центрифугируют, далее сливают верхний слой из центрифуги, а из осадка делают мазки, которые и подвергают цитологическому исследованию.

Хранение, доставка: мазки могут храниться, в принципе, долго, но, рекомендуется доставить в течение суток после взятия; жидкости, пунктаты, биоптаты, и прочий нативный материал доставляется в течение дня.

В сопровождающем материал направлении должно быть:

· фамилия, имя и отчество владельца животного;

· вид, пол, порода, возраст, кличка животного, № микрочипа;

· каким образом и откуда получен материал;

· в каком виде направляется (жидкость, стекла-мазки), количество;

· краткий анамнез с обязательным указанием на наличие и характер вредных воздействий, предшествующего лечения (в особенности гормонального, лучевого, химиотерапии);

· данные других методов исследования (рентген, УЗИ, эндоскопия и др.), анализ крови и прочее;

· описание status localis (местного процесса);

· клинический диагноз.

Факторы, влияющие на результаты:

- во взятом материале много крови (попали в сосуд), диагностически значимых клеток может не быть, или их количество очень мало;

- взятие отделяемого с поверхности язв, ран, и прочего не всегда содержит диагностически значимые клетки;

- отсутствие четкого описания материала (смотри выше!!!) может привести к неверной оценке цитограммы, или неверному методу исследования (разный материал исследуется по-разному!!!).

13.2. гистологическое исследование (Код 803)

Исследование в Лаборатории «Шанс Био» - 7- 10 дней.

Исследуемый материал: фрагменты органов, тканей, образований толщиной не более 1,0 см, поместить в любую подходящую емкость (флаконы для мочи или кала с красной или голубой крышкой),залить раствором Формалина 10-40%

Хранение, доставка: Материал доставляется в течение суток. Допускается более длительное хранение в холодильной камере (4^оС).

ВАЖНО: обязательно прикладывается описание:

· исходный размер образования (органа, ткани)

· каким образом и откуда получен материал;

· в каком виде направляется, количество фрагментов;

· данные других методов исследования (рентген, УЗИ, эндоскопия и др.), анализ крови и прочее;

· описание status localis (местного процесса);

клинический диагноз.