Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации реагентов

Основы кинетики ферментативных реакций были разработаны в 1913 году Л. Михаэлисом и М. Ментен, и основное уравнение кинетики этих реакций носит их имена.

Согласно модели Михаэлиса-Ментен, фермент Е и субстрат S взаимодествуют со скоростью, характеризуемой константой скорости , образуя фермент-субстратный комплекс ЕS, получивший название комплекса Михаэлиса. Поскольку реакция образования комплекса ЕS обратима, этот комплекс, в котором субстрат, присоединенный к ферменту нековалентными связями, еще сохраняет свою химическую природу, может распадаться в результате обратной реакции на фермент и субстрат с константой скорости_. Фермент-субстратный комплекс, однако, может далее превратиться и в продукт (или продукты) Р, высвободив фермент Е, со скоростью, характеризуемой константой .

Е + S « ES ® Р + Е

Величина, обратная константе равновесия образования комплекса ЕS, назывется субстратной константой К_S

К_S = ¾

По закону действия масс скорость образования продукта реакции Р пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса:

d[ES]

V₂ = - ------- = [ES],

dt

а скорость образования самого комплекса ЕS:

d[ES]

------- = [E] × [S]

dt

Скорость же его распада определяется суммой двух процессов: диссоциацией на исходные компоненты распадом с образованием продукта Р:

d[ES]

- ------- = ( + ) × [ES],

dt

Для стационарного процесса, когда скорости образования и распада комплекса Михаэлиса равны, то есть случая, когда сохраняется постоянной его концентрация, справедливо равенство:

[E] × [S] = ( + ) × [ES],

Откуда следует выражение для концентрации комплекса ES:

[E] × [S] [E] × [S]

[ES] = ------------------- = ------------------------

( + ) ( + )/

Дробь К_m = ( + )/

называется константой Михаэлиса. Она характеризует соотношение скоростей распада комплекса ЕS в обе стороны и его образования. Если мала по сравнению с , то величиной можно пренебречь, и константа Михаэлиса

К_m = -------

оказывается равной константе диссоциации субстрата К_S

[E] [S]

К_S = ------- = --------------- = К_m

[ES]

Это равенство справедливо, так как фермент-субстратный комплекс как раз чаще распадается на исходные компоненты, чем превращается в продукт,

Заменяя дробь в знаменателе уравнения для концентрации ЕS на К_m, получаем:

[E] ×[S]

[ES] = --------

К_m

В это уравнение входят текущие концентрации фермента и субстрата [E] и [S], которые не совпадают с начальными концентрациями. Если субстрат находится в избытке по сравнению с ферментом и степень его превращения мала, то текущая концентрация субстрата мало отличается от начальной, напротив, текущая концентрация фермента существенно отличается от начальной , так как фермент связывается в фермент-субстратный комплекс.

Поэтому [E] = [Е]_о - [ES]

Учитывая эти условия, можно записать:

([Е]_о - [ES]) ×[S] [Е]_о×[S]

[ES] = ------------------- или [ES] = ---------------

К_m К_m +×[S]

Так как скорость всего процесса V = [ES], то

[Е]_о×[S]

V = -------------------

К_m +×[S]

Это выражение и является уравнением Михаэлиса-Ментен, устанавливающим зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и субстрата.

Из выведенного уравнения следует, что скорость реакции пропорциональна общей концентрации фермента (рисунок),

тогда как ее зависимость от концентрации субстрата оказывается более сложной (рис.).

Из графика зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата видно, что эта зависимость имеет вид гиперболы (кривой насыщения). Полное насыщение наступает при высокой концентрации субстрата, когда все молекулы фермента находятся в составе комплекса ES, то есть [ES] = [E], при этом скорость становится максимальной.

Анализ кривой показывает, что при невысоких концентрациях субстрата, когда [S]<< К_m величиной [S] в знаменателе уравнения Михаэлиса-Ментен можно пренебречь, и уравнение приобретает вид прямой линии (начальный участок кривой):

×[Е]_о×[S]

V=--------------- ,

К_m

а отношение -------- является константой скорости бимолекулярной

К_m

реакции. Этот случай имеет место при низкой концентрации субстрата и плохом связывании его с ферментом. Если же [S]>> К_m, то есть фермент хорошо связан с субстратом, концентрация которого велика, то в этом случае можно пренебречь в знаменателе уже величиной К_m, и скорость реакции оказывается пропорциональной только концентрации фермента, а от концентрации субстрата не зависит: V= ×[Е]_о.

Поскольку для определения скорости ферментативной реакции и оценки эффективности взаимодействия фермента с субстратом главным является определение скорости диссоциации комплекса ЕS, то первостепенное значение имеет определение величины К_m (К_s). Это достигается решением уравнения Михаэлиса-Ментен в отношении частного случая, при котором определяется скорость ферментативной реакции, соответствующая половине V_max, то есть случая , когда V = 1/2 V_max.

Подставив эту величину в уравнение Михаэлиса-Ментен, имеем

[Е]_о×[S] V_max×[S]

1/2 V_max = ------------------- = ------------

К_m +×[S] К_m +×[S]

Преобразование этого выражения приводит к выводу, что при полунасыщении, когда половина молекул фермента находится в комплексе, и скорость реакции равна 1/2V_max, то К_m, = [S].

С учетом введенного понятия V_max, уравнение Михаэлиса-Ментен приобретает вид:

V_max ×[S]

V=---------------

К_m +[S]

Константа Михаэлиса К_m и V_max являются важнейшими кинетическими характеристиками ферментативной реакции. Их можно определить экспериментально, измеряя скорость реакции при разных концентрациях субстрата и построив прямолинейную зависимость 1/V = f(1/[S]), имеющую вид:

1 К_m +[S] 1 К_m

----- = ------------- = -------- + --------------- (рисунок)

V V_max ×[S] V_max V_max ×[S]

К_m

Как видно из графика, tg j = --------, а отрезки «а» и «в» соответственно

V_max

1 1

а = ------ и b = - -------

V_max К_m

Величины К_m и V_max дают возможность количественно характеризовать эффективность ферментов и сравнивать их действие на различные субстраты.