С помощью цоликлонов Анти-А, Анти-В, Анти – АВ
Оборудование:
1. Эритротест - цоликлоны Анти-А, Анти-В, Анти – АВ
2. Сухие чистые пипетки
3. Изотонический раствор хлорида натрия 0,9 %.
4. Сухая тарелка.
5. Скарификаторы
6. Стерильные марлевые шарики
7. Спирт
8. Стеклянные палочки
Ход работы:
1. Нанесите на планшет или пластину индивидуальными пипетками Цоликлоны Анти – А, Анти – В и Анти АВ по одной большой капле (0,1мл.) под соответствующими надписями.
2. Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01-0,03мл.)
3. Смешайте кровь с реагентом.
4. Наблюдайте за ходом реакции с Цоликлонами визуально при лёгком покачивании пластины или планшета в течение 3 минут. Агглютинация эритроцитов с Цоликлонами обычно наступает в первые 3-5 сек, но наблюдение следует вести 3 мин. ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами
5. Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро сливающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остаётся равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.
6. Интерпретация результатов реакции агглютинации исследуемой крови с Цоликлонами представлена в таблице.
| Результат реакции* с Цоликлоном: Анти-А Анти-В Анти-АВ | Исследуемая кровь принадлежит к группе** | ||
| - | - | - | 0(I) |
| + | - | + | А(II) |
| - | + | + | В(III) |
| + | + | + | АВ(IV) |
* Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) – отсутствие агглютинации.
** Окончательно АВО принадлежность устанавливается по результатам перекрёстного определения: антигенов А и В на эритроцитах и изогемагглютининов в сыворотке.
Определение резус–фактора – Rh0 (D) реакцией конглютинации с применением 10 % раствора желатина.
1. В 2 пробирки вводят по одной капле (0,05 мл.) исследуемых эритроцитов и по 2 капли 10 % раствора желатина, подогретого до разжижения в тёплой воде (46 – 480 С).
2. В одну из этих пробирок к смеси эритроцитов и желатина добавляют 2 капли сыворотки анти-резус. В другую пробирку эту сыворотку не добавляют; она служит контролем для исключения возможности проявления аутоагглютинации испытуемых эритроцитов.
3. Кроме того, для контроля параллельно исследуют стандартные резус-положительные эритроциты той же группы или группы 0(I) и резус-отрицательные эритроциты, одногруппные с испытуемой кровью.
4. Содержимое пробирок перемешивают путём встряхивания и помещают пробирки в водяную баню при 46-480 С на 10 мин. или в суховоздушный термостат при той же температуре на 30 мин.
5. После инкубации в пробирки добавляют по 5-8 мл. изотонического раствора хлорида натрия, перемешивают содержимое путём перевёртывания пробирок 1-2 раза и оценивают результат.
Трактовка результатов.
1. Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу с двукратным увеличением. Результат трактуют в зависимости от наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
2. При положительном результате агглютинация легко различимы в виде красных зёрен или хлопьев на прозрачном, почти обесцвеченном фоне жидкости.
3. При отрицательном результате в пробирке видна равномерно окрашенная в розовый цвет, слегка опалесцирующая жидкость.
4. Образцы эритроцитов, вызвавшие агглютинацию с сывороткой антиRh 0 (D), являются резус положительными (Rh+),образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-Rh0(D), - резус-отрицательными (Rh -).
Результат учитывают как истинный при наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами, в отсутствие агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами, а также в отсутствие агглютинации (аутоагглютинации) в контрольной пробирке, в которую были помешены только эритроциты и желатин, но не добавлена сыворотка анти-резус.
Определение резус-фактора Rh0(D) при помощи стандартного универсального реагента с 33% раствором полиглюкина.
1. В пробирку вводят одну каплю (0,05 мл.) исследуемой крови или эритроцитов (можно не отмывать от консерванта), добавляют 2 капли стандартного универсального реагента анти-резус и перемешивают эритроциты с реагентом путём встряхивания пробирки.
2. Пробирку наклоняют почти до горизонтального положения так, чтобы содержимое растеклось по её стенкам, а затем медленно поворачивают в таком положении вокруг горизонтальной оси, осуществляя контакт эритроцитов с реагентом анти-резус в течение 3 мин. Это способствует агглютинации эритроцитов.
3. Как правило, агглютинация наступает в течение 1-й минуты, но для более четкого проявления её и образования устойчивого комплекса, а также ввиду возможности замедленной реакции при слабо выраженной агглютинабельности эритроцитов контакт эритроцитов с реагентом следует проводить не менее 3 мин.
4. По истечении 3 мин. для исключения неспецифической аггрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл. изотонического раствора хлорида натрия и перемешивают содержимое (не взбалтывая!), 2-3 раза переворачивая пробирку.