Определение активности липазы

В растениях липазы широко распространены. Особенно их много в семенах масличных культур. У каждого вида растений есть свои липазы, проявляющие свою активность при различных значениях рН, потому иногда различают кислую, нейтральную и щелочную липазы, которые проявляют свою максимальную активность соответственно в кислой, нейтральной или щелочной среде. В семенах масличных культур содержатся в основном кислые и щелочные липазы.

Принцип метода. Основан на определении количества жирных кислот, образующихся при действии липаз на растительный жир. В качестве источника липаз используют семена масличных культур. Титрование образовавшихся кислот щелочью происходит по схеме:

RСООН + NаОН ¾¾¾® RСООNа + Н₂О

Активность липаз определяют в слабокислой или щелочной среде.

Ход работы. 2–3 г масличных культур растирают в ступке, в растертую массу добавляют 50 мл кислого или щелочного буфера и смесь тщательно перемешивают. Кислый ацетатный буфер (рН = 4,7) готовят смешиванием разных объемов растворов 1 н. уксусной кислоты и 1 н. уксусного натрия или уксусного аммония и 2 объемов воды. Для приготовления щелочного боратного буфера (рН = 8,5) растворяют в воде 12,404 г борной кислоты, прибавляют 100 мл 1 н NаОН и доводят общий объем раствора до 1 л. Из этого раствора берут 650 мл, прибавляют к нему 350 мл, 0,1 н раствора НСl и тщательно перемешивают. Полученные смеси переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10–15 мин 5 тыс. об/мин. Для определения ферментативной активности из каждой пробирки берут 2 пробы по 20 мл и переносят их в конические колбы на 100 мл с притертыми пробками. Содержимое одной из колб кипятят 3 минуты для инактивации ферментов. Затем в колбы вносят по 1 мл чистого подсолнечного масла, которое служит субстратом для действия липаз, добавляют по 5 капель толуола, перемешивают и ставят в термостат при 30 °С на 20–24 ч.

После инкубации в термостате во все колбы приливают по 50 мл смеси этилового спирта с эфиром (4:1) и взбалтывают. После отстаивания титруют 0,1 н спиртовым раствором NаОН в присутствии нескольких капель тимолфталеина.

Вычисление результатов. Активность кислых и щелочных липаз выражают в миллилитрах 0,1 н. NаОН, пошедшей на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся в результате действия липаз на 1 г семян. Расчеты проводят по формуле:

, (18)

где Е_а – активность липазы, мл/г;

V₁ – количество 0,1 н. NаОН, израсходованное для титрования опытного образца, мл;

V₂ – количество 0,1 н NаОН, израсходованное для титрования контрольного (предварительно прокипяченного) образца, мл;

Т– поправка к титру 0,1 н. NаОН;

m – навеска семян, соответствующая объему вытяжки (20 мл), взятому для определения ферментативной активности, г.

Материалы и реактивы. Ацетатный буфер рН 4,7 (см. Приложение 1, п.10);
0,2 М боратный буфер рН 8,5; 0,1 н. NаОН; этиловый спирт; эфир; подсолнечное масло; толуол; 1 %–ный спиртовой раствор тимолфталеина.

Оборудование. Автоматическая мешалка; термостат; ступки фарфоровые; конические колбы на 100 мл с притертыми пробками; пипетки.

Приложение 1

1. В нескольких мл воды растворяют 1 г йодистого калия, затем растворяют 1 г йода и доливают водой до 300 мл; 3 г йодистого калия растворяют в 70 мл воды в мерной колбе емкостью 100 мл добавляют 0,3 г. растертого в ступке йода и после растворения йода доводят водой до метки. Раствор хранят в темной склянке.

2. Фосфатный буфер, 0,1 М раствор, рН = 5,6. Состоит из двух растворов:

а) 0,1 М раствор двухзамещенного фосфорнокислого натрия (17,8 г Na₂НРО₄ ×2Н₂О или 35,82 Na₂НРО₄ × 12 Н₂О в 1 л);

б) 0,1 М раствор однозамещенного фосфорнокислого натрия (18,8 г NaН₂РО₄ × Н₂О или 31,21 г NaН₂РО₄ .2Н₂О в 1 л). При смешивании 4,0 мл раствора "а" и 96 мл раствора "б" получают буферную смесь м рН 5,6.

3. Фелинг II. 200 г сегенетовой соли растворяют в 500 мл воды, 150 г гидроксида натрия растворяют в 300 мл воды, затем раствор щелочи осторожно приливают к раствору соли и объем доводят водой до 1 л.

4. Железоаммиачные квасцы, раствор. 86 г железоаммиачных квасцов растворяют в 500 мл воды и осторожно по стенкам приливают 200 г (108 мл) концентрированной серной кислоты, объем доводят водой до 1 л.

5. (9,077 г/л КН₂РО₄ и 23,283 г/л Nа₂РО₄×12Н₂О); для приготовления буфера смешивают 5,5 мл первого раствора и 94,5 мл второго раствора.

6. Приготовление 0,1 %–ного раствора казеина. 3,8 г Nа₃РО₄ ×12Н₂О растворяют в 80 мл дистиллированной воды при 40 °С, добавляют 100 мг казеина и после полного растворения последнего устанавливают рН смеси 1 н. НСI на уровне 6.5; объем раствора доводят дистиллированной водой.

7. Реактив Фолина. В круглодонную колбу на 1,5–2,0 л вносят 100 г вольфрамовокислого натрия–гидрата (NaWО₄ .2Н₂О), 25 г молибденовокислого натрия–гидрата (NaМоО₄ ×2Н₂О), 750 мл дистиллированной воды, 50 мл 85% фосфорной кислоты Н₃РО₄ и 100 мл концентрированной соляной кислоты, после чего смесь нагревают при умеренном кипячении с обратным холодильником. После кипячения прибавляют 150 г сернокислого лития 50 мл дистиллированоой воды, 5 капель бромной воды. Избыток удаляют кипячением под тягой без холодильника в течении 30 минут,после чего жидкость охлаждают и разводят дистиллированной водой до 1 литра. Хранят в темной склянке. Перед употреблением реактив разводят водой в отношении: реактива: 3 части дистиллированной воды.???

8. 1 г казеина растворяют при нагревании на водяной бане в 10 мл 10 %–ной НСI и прибавляют воды до объема 1000 мл;

9. Ацетатный буфер, 0,3 М раствор, рН 4,7. Состоит из двух растворов в соотношении 1:1:

а) 0,3 М раствор уксусной кислоты;

б) 0,3 М раствор уксуснокислого натрия.

10. Крахмал индикатор. 1 г. растворимого крахмала размешивают с 10 мл холодной воды и постепенно вливают в 90 мл кипящего насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения и охлаждают.

11. Фосфорнокислые соли, раствор. (6 г Na₂НРО₄×2Н₂О смешивают с 2 г КН₂РО₄× Н₂О в 1,0 л воды).

12. 50 г (по сухому веществу) технического измельченного казеина помещают в стакан, добавляют для набухания 50 мл дистиллированной воды и оставляют на 30 мин, затем стакан помещают на водяную баню с температурой 65–70°С. Постепенно при тщательном перемешивании стеклянной палочкой прибавляют 50 мл 1 н. раствора NаОН. В процессе растворения казеина прибавляют небольшими порциями воду (5–6 раз по 50–80 мл.), нагретую до 65–70 °С, и выдерживают на бане до полного исчезновения комочков. После полного растворения казеина и охлаждения объем раствора доводят в мерной колбе до 1 л; фильтруют через четыре слоя марли.

13. Раствор фермента.

а) для технического ферментного препарата (культура гриба) из тщательно измельченной воздушно–сухой средней пробы берут в колбу на 300–200 мл навеску 1 г (с точностью до 0,01), приливают пипеткой 50–100 мл дистиллированной воды и настаивают 1 ч при комнатной температуре, перемешивая через каждые 10 мин; по истечении 1 ч раствор фильтруют через складчатый фильтр;

б) для очищенных ферментных препаратов: на аналитических весах берут навеску средней пробы тонко измельченного препарата 0,1 г (с точностью до 0,0001), препарат тщательно растирают стеклянной палочкой в небольшом количестве воды, затем переводят в мерную колбочку на 100 мл и доводят дистиллированной раствор до метки, раствор фильтруют.

14. 2 г растительного материала растирают в ступке с песком с 5 мл фосфорного буфера, рН 7,0; переносят в коническую колбу вместимостью 50 мл, смывают ступку 20 мл буфера, настаивают 30 мин и центрифугируют 10–15 мин при 4000 об/мин.

15. На аналитических весах отвешивают по разности в мерную колбу (вместимостью 50 мл) 2 г муки или хорошо измельченного растительного продукта. В колбу приливают дистиллированную воду, содержимое ее хорошо перемешивают, добавляют 2–3 капли толуола, доводят водой до метки и смесь настаивают 2 ч при комнатной температуре. Затем жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр или центрифугируют. В фильтрате или центрифугате тот час же определяют каталазу.

16. Реактив А: (2 г NaOH и 10 г Na₂CO₃ в 500 мл дистиллированной воды); реактив В: (5 мл 1,1 %–ного раствора калия–натрия виннокислого + 0,5 мл 5,5 %–ного раствора CuSO₄×5Н₂О); реактив С (50 мл реактива А + 1 мл реактива В) готовится перед каждой работой заново;

17. Раствор ферментов: 250 мкг глюкозооксидазы из плесневого гриба и 41,7 мкг пероксидазы из корней хрена растворяют в 10 мл 0,1 М Nа–фосфатного буфера, рН 7,0.

18. 1 %– ный раствор казеина рН 8,0: 1 г казеина заливают 100 мл 1/5 М фосфатного буфера рН 8,0 и нагревают на водяной бане до полного растворения. Проверяют рН раствора и доводят его точно до 8,0. Раствор казеина можно хранить в холодильнике не более трех суток.

19. 1 %–ный раствор гемоглобина рН 3,0 готовят растиранием в ступке 1,0 г гемоглобина с небольшим количеством воды. Содержимое ступки переносят в мерную колбу на 100 мл, подкисляют 0,3 н. НСl до рН 3,0 и доводят водой до метки. Полученный раствор неустойчив, его следует готовить ежедневно.

Для приготовления растворов гемоглобина с рН 6,0 и 8,0 растворяют в 100 мл 1/15 М фосфатного буфера с соответствующим значением рН 1,1 г гемоглобина, затем в раствор добавляют 36 г мочевины и оставляют при комнатной температуре. После этого растворы доводят до нужного значения рН 1 н. NаОН или 1 н. НСl

Приложение 2

Таблица 5 – Международная классификация ферментов

№	Класс	Тип катализируемой реакции	Пример реакций
1.	Оксидоре-дуктазы	Перенос электронов и протонов
2.	Трансфе-разы	Перенос групп атомов (исключая Н)
3.	Гидро-лазы	Гидролиз различных связей (с участием молекул воды)
4.	Лиазы	Оброзование двойных связей за счет удаления групп или добавления групп за счет разрыва двойных связей
5.	Изомера-зы	Внутримолекулярный перенос групп с образо– ванием изомерных форм
6.	Лигазы (синтета-зы)	Соединение двух молекул и образование связей С¾С, С¾О, С¾N, сопряженных с разрывом пирофосфатной связи АТФ

Приложение 3

Таблица 6

Е_р на воздушно–сухое вещество

0,1 н. NаОН, мл на 10мл фильтрата	Единицы протеолитической активности, е	ПС при введении 10мл раствора при разведении
1:100	1:50
0.30	0.0123	0.615	0.300
0.35	0.0167	0.835	0.418
0.40	0.0203	1.015	0.508
0.45	0.0243	1.215	0.608
0.50	0.0283	1.415	0.708
0.55	0.0320	1.600	0.800
0.60	0.0360	1.800	0.900
0.65	0.0393	1.965	0.982
0.70	0.0433	2.165	1.082
0.75	0.0473	2.365	1.182
0.80	0.0513	2.565	1.282
0.85	0.0550	2.750	1.375
0.90	0.0590	2.950	1.475
0.95	0.0627	3.135	1.573
1.00	0.0667	3.335	1.663
1.05	0.0700	3.500	1.750
1.10	0.0747	3.735	1.868
1.15	0.0787	3.935	1.968
1.20	0.0827	4.135	2.068
1.25	0.0867	4.335	2.168
1.30	0.0907	4.535	0.375
1.35	0.0950	4.750	2.268
1.40	0.0990	4.950	2.475
1.45	0.1033	5.165	2.582
1.50	0.1080	5.400	2.700
1.55	0.1123	5.616	2.808
1.60	0.1167	5.835	2.918
1.65	0.1213	6.065	3.032
1.70	0.1260	6.300	3.150
1.75	0.1307	6.535	3.266
1.80	0.1353	6.765	3.382
1.85	0.1400	7.000	3.500
1.90	0.1453	7.265	3.632
1.95	0.1500	7.500	3.750
2.00	0.1556	7.780	3.890
2.05	0.1603	8.015	4.008
2.10	0.1653	8.265	4.132
2.15	0.1707	8.035	4.268
2.20	0.1760	8.800	4.400
2.25	0.1817	9.085	4.542
2.30	0.1873	9.365	4.632
2.35	0.1933	9.665	4.832
2.40	0.1993	9.965	4.932
2.45	0.2053	10.265	5.182
2.50	0.2113	10.565	5.232

Приложение 4

Таблица 7