Определение суммарной активности

Отдельные группы протеолитических ферментов проявляют максимальную активность при различной кислотности среды, поэтому их активность следует определять при различных значениях рН. Ниже приведен один из распространенных способов определения суммарной активности протеолитических ферментов, в основу которого положен метод Ансона.

Принцип метода. Ферментным препаратом, выделенным из растительного материала, действуют на раствор стандартного белка (казеина или гемоглобина), затем неразложившийся белок осаждают, а в фильтрате определяют количество разложившегося белка по колориметрической реакции Фолина или на спектрофотометре. Принимается, что количество разложившегося белка пропорционально содержанию в растворе тирозина. Рассчитывают протеолитическую активность ферментного препарата на 1 мг белка или на 1 г навески за 1 ч.

Ход работы. Навеску взвешивают на аналитических весах: при анализе свежего растительного материала 5 г, а семян – 2 г. Свежий растительный материал растирают в ступке с жидким азотом, а сухой – с песком и переносят в коническую колбу. Ступку смывают водой. Общий объем воды, добавляемой к навеске, должен быть 50 мл. После этого суспензию настаивают в течение 1 ч в холодильнике при периодическом помешивании. После настаивания суспензию фильтруют в сухой стакан или колбу через складчатый фильтр или осадок отделяют центрифугированием в течение 10–15 мин при 5–6 тыс. об/мин. В качестве ферментного препарата используют фильтрат или надосадочную жидкость.

При определении активности протеолитических ферментов в 2 пробирки приливают по 2 мл ферментного препарата. В одну из пробирок (контрольную) прибавляют 4 мл 14%–ного раствора трихлоруксусной кислоты для инактивации фермента. Затем в пробирки добавляют по 2 мл субстрата (1%–ного раствора казеина или 1%–ного гемоглобина) и тщательно перемешивают. Пробирки инкубируют на водяной бане при 30° С точно 30 мин. За это время под действием протеолитических ферментов частично гидролизуется внесенные в опытную пробирку казеин или гемоглобин.

Через 30 мин в опытную пробирку для прекращения действия ферментов добавляют 4 мл 14 %–ного раствора трихлоруксусной кислоты. После этого содержание пробирок фильтруют через плотный фильтр (фильтрат должен быть совершенно прозрачным) и в фильтрате определяют количество тирозина, образовавшегося в результате расщепления белков под действием протеолитических ферментов.

Количество тирозина определяют по реакции с реактивом Фолина. Для этого к 0,5 мл фильтрата из каждой пробирки добавляют по 0,5 мл 0,0025 М раствора СuSО₄, по 4 мл 0,5 н. раствора NаОН и по 1,5 мл разбавленного в 3 раза реактива Фолина. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и через 20–30 мин после стабилизации окраски определяют оптическую плотность на спектрофотометре при 760 нм или фотоэлектроколориметре с красным светофильтром.

Вычисление результатов. При спектрофотометрических определениях вычисляют разность D₀–D_к, где D₀– оптическая плотность опытного образца, D_к – оптическая плотность контрольного образца. Протеолитическую активность препарата выражают в единицах протеолитической активности на 1 мг белка, содержащегося в ферментном препарате (для этого необходимо определить содержание белка в нем), или на 1 г навески растительного материала за 1 ч.

Пример расчета. Допустим, что оптическая плотность опытного образца 0.400, а контрольного 0,240, т. е. разность составляет 0,160. Навеска материала 2 г. Разбавление 50 мл. Для анализа взято 2 мл ферментного препарата, что соответствует навеске 0,08 г. Для пересчета протеолитической активности на 1 г необходимо 0,160 разделить на 0,08, что дает 2,00 за 30 мин, а для перевода на 1 ч результат умножают на 2. Таким образом, условная протеолитическая активность исходного материала составляет 4,00 единицы.

Общая формула для расчета:

, (14)

где Е_р – протеолитическая активность (в условных единицах);

D₀ – оптическая плотность опытного раствора после окрашивания ;

D_к – оптическая плотность контрольного раствора после окрашивания ;

2 – коэффициент для пересчета на 1 г;

50 – общий объем вытяжки, мл;

m – навеска растительного материала, г;

V – объем вытяжки ферментного препарата, взятый для анализа, мл.

Материалы и реактивы. 1 %–ный раствор казеина (см. Приложение 1, п.19);
1 %–ный раствор гемоглобина (см. Приложение 1, п. 20); жидкий азот; реактив Фолина (см. Приложение 1, п. 8); 0,5 и 1 н. NаОН; 1 н. и 0,3 н. НСl; 14 %–ная трихлоруксусная кислота; 0,0025 М раствор СиSO₄; 0,5 М раствор Na₂CO₃; 1/5 М фосфатный буфер рН 8,0 (см. Приложение 1, п.6).

Оборудование. Спектрофотометр; ступка фарфоровая; центрифуга; холодильник; водяная баня; колбы мерные на 50 и 100 мл; конические колбы на 100 мл; воронки; градуированные пипетки; пробирки.