Определение активности протеаз по методу Ансона

Принцип метода. Заключается в определении количества аминокислоты тирозин, образующейся при гидролизе ферментным препаратом стандартного белка (казеина, казеината натрия или гемоглобина).

Непрореагировавший белок осаждают, а белок, подвергшийся гидролизу пропорционально содержанию тирозина, определяют колориметрически реакцией Фолина. Полученные величины оптической плотности подставляют в формулу и рассчитывают протеолитическую активность ферментного препарата.

Протеолитическая активность характеризует способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеазы в 1 г очищенного препарата.

За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 °С превращает в неосажденные трихлоруксусной кислотой продукты гидролиза казеината натрия в количестве, соответствующем 1 мкмоль тирозина (1 мкмоль тирозина составляет 0,181 мг).

Данный метод позволяет определить активность протеаз грибного и бактериального происхождения при рН среды: кислые 2,5 и 5,5, нейтральные 7,2 и щелочные 9,5.

Ход работы. Построение градуировочной кривой.

В 1 л 0,2 н раствора соляной кислоты растворяют 181,2 мг тирозина (основной раствор). Из основного раствора готовят разбавленные. Для этого в мерную колбу на 50 мл раствор вносят в количествах указанных в таблице 4. Объем в колбах доводят до метки 0,2 н раствором соляной кислоты.

В 7 пробирок вносят по 1 мл раствора тирозина разной концентрации, добавляют в них по 5 мл 0,5 М карбоната натрия и 1 мл раствора Фолина. В контрольном опыте вместо раствора тирозина берут 1 мл дистиллированной воды. Через 20 минут растворы колориметрируют при 656–670 нм и строят градуировочную кривую.

Таблица 4 – Результаты определения оптической плотности

№	Кол-во основного раствора, мл	Концентрация тирозина, мкмоль/ мл	Оптическая плотность	Примечание
1-е определение	2-е определение	3-е определение	Среднее значение
1.	1,0	0,02
2.	2,0	0,04
3.	4,0	0,08
4.	5,0	0,10
5.	7,5	0,15
6.	10,0	0,20
7.	15,0	0,30

Для этого на оси абсцисс откладывают количество тирозина С (в мкмоль/мл), на оси ординат – соответствующее значение оптической плотности Д. Тирозиновый эквивалент (ТЭ) определяют из соотношения:

,(12)

где D – оптическая плотность;

С– содержание тирозина в 1 мл раствора, мкмоль.

Приготовление ферментного раствора. 0,1–1,0 г исследуемого препарата растирают стеклянной палочкой в стаканчике на 50 мл с небольшим количеством буферного раствора с рН 5,5. Затем содержимое стаканчика количественно переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят этим же буферным раствором до метки.

Из полученного раствора путем разведения готовят рабочий раствор до необходимой концентрации фермента. Разведение должно быть подобрано так, чтобы в реакционной среде был избыток субстрата, а измеряемые оптические плотности при колориметрировании в кювете с рабочей гранью 10 мм находились в пределах от 0,1 до 0,75.

Определение активности протеаз. В пробирку на 20 мл наливают 2 мл 2 %– ного раствора казеината натрия, помещают ее в термостат при 30 °С и через 5–10 минут добавляют 2 мл ферментной вытяжки, перемешивают и выдерживают при 30°С 30 минут. Казеинат при этом частично гидролизуется. Для инактивации действия ферментов в пробирку прибавляют 4 мл 0,3 М–ной трихлоруксусной кислоты, встряхивают и оставляют пробирку еще на 20 минут при 30°С. После этого содержимое пробирки фильтруют или центрифугируют. В сухую пробирку вносят 1 мл фильтрата, 5мл 0,5 М раствора карбоната натрия, перемешивают, приливают 1 мл реактива Фолина. Через 20 минут определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектро-колориметре при 670 нм в кювете толщиной 10 мм в сравнении с контрольной пробой. Для получения контрольной пробы 2 мл разведенного ферментного раствора приливают к 4 мл 0,3 М раствора ТХУ, выдерживают в термостате при 30 °С 10 мин, а затем к раствору добавляют 2 мл субстрата. После перемешивания пробирку выдерживают 20 минут при 30 °С, фильтруют и отбирают 1 мл субстрата в сухую пробирку.Туда же вносят 5 мл раствора карбоната натрия и 1 мл реактива Фолина. Полученный раствор используют в качестве сравнения при замерах.

Протеолитическую активность (Е_р) препарата (в ед/г) определяют по формуле:

(13)

где Е_р– протеолитическая активность, ед/г;

D –оптическая плотность;

4 – отношение объемов реакционной смеси и раствора фермента после
добавления трихлоруксусной кислоты;

ТЭ – тирозиновый эквивалент;

10 – время гидролиза, мин;

а – количество ферментного препарата в пробе, мг;

1000 – пересчет в ед/г.

Тирозиновый эквивалент определяют для каждого фотоэлектроколориметра и реактивов путем построения градуировочной кривой.

Материалы и реактивы. Ферментативный препарат; казеинат натрия, 2 %–ный раствор; 0,1 М раствор универсального буфера, рН 5,5; 0,3 М раствор трихлоруксусной кислоты; 0,2 н. раствор соляной кислоты; 0,5 М раствор карбоната натрия; реактив Фолина (см. Приложени 1, п. 8); тирозин.

Оборудование. Фотоэлектроколориметр; центрифуга; термостат; стаканы на 50 мл; колбы мерные на 50, 100, 1000 мл; пробирки на 10, 20 мл; пипетки на 2,5 мл.