К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

(для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Введение в биохимию, современные методы исследования.

2. Учебная цель занятия: Ознакомиться с предметом биохимии, методами и техникой лабораторных работ.

3. Задачи занятия:

1. Получить представление о предмете биохимии: целях, задачах, областях применения, основных достижениях; о структуре предмета и практических занятиях, правилах техники безопасности и культуре поведения в лабораториях кафедры.

2. Изучить методику получения биологического материала: плазмы, сыворотки крови, гомогената и экстрактов тканей, органелл клеток, клеток тканей.

3. Научиться работать на центрифуге.

4. Провести исследование содержания аминокислот в плазме крови, методом хроматографии.

5. Научиться работать на фотоэлектроколориметре.

6. Ознакомиться с принципом действия биохимического анализатора, его возможностями и спектром применения.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Получение плазмы крови методом центрифугирования.

2. Тонкослойная хроматография аминокислот плазмы крови.

3. Фотоэлектроколориметр: принцип метода, техника работы на приборе.

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Получение плазмы крови методом центрифугирования.

Принцип метода: Принцип центрифугирования основан на том, что клетки крови осаждаются в центробежном поле. Скорость сендиментации (осаждения) зависит от плотности раствора, молекулярной массы, формы, размеров осаждаемых частиц (органелл или клеток и др.).

Ход работы: Цитратная кровь, приготовленная лаборантами, наливается в центрифужную пробирку 1,0 мл, а в противовес ей готовят центрифужную пробирку с 1,0 мл воды. Обе пробирки устанавливают в противоположные гнезда ротора центрифуги. Закрывают крышку центрифужной камеры и включают центрифугу на 5 минут, плавно разгоняя ротор до 3000 об/мин. По окончании центрифугирования, при полной остановке ротора, открывают крышку и достают пробирки. Полученная плазма крови или образующаяся при центрифугировании гомогенатов тканей надосадочная жидкость используется для хроматографии аминокислот в работе № 2.

Работа № 2. Тонкослойная хроматография плазмы крови.

Принцип метода: Тонкослойная хроматография основана на различии в степени адсорбции разделяемых веществ микропористым адсорбентом (окись алюминия и др.) и их растворимости в растворителе.

Ход работы:

а) Каплю плазмы капилляром нанести на линию старта хроматографической полоски и сушить на воздухе 2-3 минуты. б) Каплю смеси эталонных образцов (фен и глу) капилляром нанести на линию старта другой полоски, и просушить 2-3 минуты.
Обе полоски поместить в хроматографические камеры (большие пробирки), погружая их на 2-3 мл в растворитель (вода:бутанол:ацетат) на 60 минут для хроматографического разделения.
По окончании разгонки отмечают фронт распространения растворителя и сушат в термостате 3-5 минут.
Хроматографические полоски проявляют нингидрином, дающим с аминокислотами цветную реакцию и вновь сушат в термостате до появления ярко выраженных цветных пятен. Наличие аминокислот может быть идентифицировано с помощью коэффициента распределения (Rf): Rf = a/b, где a – расстояние пройденное аминокислотой от линии старта, b – расстояние пройденное растворителем от линии старта.

Данный метод должен проводиться с соблюдением всех условий, указанных в справочнике: температура, время разгонки, растворитель. По этому наиболее простым и применимым является метод эталонных образцов (метод «свидетелей»), который заключается в том, что исследуемая смесь аминокислот и известные аминокислоты («свидетели») наносятся на линию старта одновременно и разгоняются в одинаковых условиях.

Работа № 3. Фотоэлектроколориметрия.

Принцип метода: фотометрия основана на измерении поглощения света определенной длины волны проходящего через исследуемый раствор. Окрашенные растворы образуются после проведения цветных реакций, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации определяемых веществ. Цифровые величины, регистрируемые фотоэлектроколориметром на шкале оптической плотности прибора (нижняя шкала), отражают экстинцию (Е) – оптическую плотность.

Ход работы:

Знакомство с прибором и прилагаемой к нему инструкцией.
Определение экстинции опытного (Еоп) и стандартного (Ест) растворов и перевод

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 1 - student2.ru

экстинции в концентрации (Соп и Сст) с помощью калибровочного графика, построенного по нескольким стандартным концентрациям изучаемых веществ. Если график окажется прямолинейным, то для простоты можно произвести расчет опытной концентрации (Соп) исходя из значения одной стандартной концентрации (Сст) по формуле: С_ОП = С_СТ• Е_ОП/Е_СТ

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов