К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 2

(для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Ферменты: строение и свойства.

2. Учебная цель занятия: Изучить особенности строения и основные свойства ферментов, методы определения их активности.

3. Задачи занятия:

1. на основе знаний по биоорганической химии систематизировать сведения о строении и основных свойствах белков, их биологической (каталитической) роли в организме.

2. изучить строение ферментов, знать отличия в строении простых и сложных ферментов, локализацию ферментов в клетке, изоферменты.

3. познакомиться с основными методами качественного обнаружения и количественного определения активности ферментов.

4. в ходе выполнения практической работы познакомиться с методами осаждения белков, обнаружить кофермент НАД в дрожжах, исследовать амилазную активность слюны.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Изучить денатурацию белков под действием растворов минеральных и органических кислот и при нагревании.

2. Обнаружить кофермент НАД в дрожжах.

3. Определить амилазную активность в моче (сыворотке крови).

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Денатурация белков под действием кислот и при нагревании.

Принцип метода: денатурация - это нарушение структурной организации белковой молекулы, приводящее к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Большинство белков теряют биологическую активность в присутствии сильных минеральных и органических кислот, при обработке ПАВ, органическими растворителями, солями тяжелых металлов и под действием физических факторов (температура, ультразвук, радиация). Денатурации предшествует нарушение гидратной оболочки и снятие заряда белка, в силу чего он становится менее гидрофильным и легко осаждается.

Ход работы:

1). Осаждение белка минеральными кислотами.

В пробирку наливают 15-20 капель концентрированной азотной кислоты (HNO₃) и осторожно по стенке приливают равный объем раствора белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде небольшого белого кольца.

2). Осаждение белка органическими кислотами.

В пробирку наливают 5-10 капель раствора белка и добавляют 3-5 капель 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Образуется осадок белка.

3). Осаждение белка при нагревании.

В пробирку наливают 5-10 капель раствора белка и содержимое пробирки нагревают над спиртовкой, Жидкость мутнеет.

Клинико-диагностическое значение.

Осаждение белка с помощью ТХУ широко используется в клинической практике для обнаружения белка в биологических жидкостях (моча, экссудаты и др.).

В клинической практике выполнению анализа сыворотки крови на содержание малых молекул (глюкоза, мочевая кислота и т.д.) предшествует осаждение белков действием минеральных кислот или ТХУ.

Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимого осадка используется как противоядие при отравлениях солями тяжелых металлов.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

В выводах отразить причины осаждения белков из растворов, влияние денатурирующих факторов на активность ферментов.

Работа № 2. Обнаружение никотинамидадениндинуклеотида (НАД) в дрожжах.

Принцип метода: В процессе тканевого дыхания водород от оксиляемого субстрата с помощью ферментов дегидрогеназ переносится на коферменты ФАД или НАД⁺. НАД⁺ - кофермент, содержащий витамин РР, встречается во многих тканях и органах человека и животных, много его и в дрожках. Этот кофермент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуоресцирующего комплекса с ацетоном.

Ход работы: В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4-5 мм, добавляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20-З0 С, не допуская выброса жидкости. В пустую пробирку отфильтровывают 5-10 капель полученного экстракта и добавляют туда 3-5 капель ацетона, 1-2 капли раствора фенолфталеина и по каплям соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина, встряхивая при этом пробирку. Помещают пробирку на 2 мин в кипящую водяную баню, после чего вынимают, охлаждают и подносят к включенному флюорометру. Ацетоновый комплекс флюоресцирует синим цветом.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

1. Приведите структурную формулу кофермента НАД, выделив его рабочий фрагмент.

2. Напишите в общем виде реакцию дегидрирования субстрата с участием НАД⁺.

Работа № 3. Определение амилазной активности в моче (крови) методом Каравея со стойким крахмальным субстратом.

Принцип метода: α-амилаза гидролизует крахмал с образованием продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности α-амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.

Ход работы: (микрометод). 0,5 мл субстратно-буферного раствора помещают в пробирку, нагревают 5 мин при 37˚С, добавляют 0,01 мл исследуемой биологической жидкости. Инкубируют 7,5 мин при 37˚С. Время инкубации необходимо точно отсчитывать по секундомеру с момента добавления биологической жидкости в крахмальный субстрат. Тотчас же после инкубации добавляют 0,5 мл 0,01 Н раствора йода и доводят объем дистиллированной водой до 5 мл. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) против дистиллированной воды.

Расчет. Активность α-амилазы выражают в мг или г крахмала, гидролизованного 1 л биологической жидкости за 1 с инкубации при 37˚С. Расчет проводят по формуле:

А=((Е_К-Е_О)/Е_К)• (0,2•10⁵/7,5•60) или А=((Е_К-Е_О)/Е_К)•44,4, где

А – активность α-амилаза, мг/(с•л),

Е_К – экстинция контрольной пробы,

Е_О – экстинция опытной пробы,

0,2 – количество, крахмала введенного в опытную и контрольную пробы, мг.

10⁵ – коэффициент перерасчета на 1 с инкубации.

Нормальные значения. Сыворотка крови: 3,3-8,9 мг/(с•л), Моча: до 44 мг/(с•л).

Клинико-диагностическое значение. Повышение активности α-амилазы в крови и моче наблюдается при остром панкреатите (до 90% и более), а также при вирусном гепатите и раке поджелудочной железы. Труднообъяснимую гиперамилаземию вызывают холецистит, перитонит, ожоги, острый аппендицит. Употребление многих фармакологических препаратов (кортикостероиды, салицилаты, тетрациклин, гистамин) приводит к повышению уровня активности α-амилазы. При почечной недостаточности α-амилаза в моче отсутствует.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

Результаты работы оформите в виде таблицы:

Название фермента	α-амилаза
Исследуемый материал
Субстрат
Условия определения	фосфатный буфер; рН 7,0; 37°С (по убыли крахмала)
Найденная активность α-амилаза
Активность α-амилазы в норме
Вывод