Получение безбелкового экстракта сыворотки крови для исследования продуктов ПОЛ
В две центрифужные пробирки № 1 и № 2 внести по 0,5 мл сыворотки крови больного и здорового человека и по 3,0 мл р-ра ТХУ кислоты, содержимое пробирок тщательно перемешать стеклянной палочкой и центрифугировать в течение 5 минут при 4 тыс. об/мин.
Обе надосадочные жидкости осторожно слить в чистые пронумерованные пробирки и использовать для определения в них продуктов ПОЛ.
Работа № 1. Исследование содержания перекисных радикалов и гидроперекисей липидов.
Принцип метода: В процессе ПОЛ образуются перекисные радикалы и перекиси липидов, которые при взаимодействии с Fe2+ окисляют его до Fe3+ по схеме:
R-OO. + Fе2+ + Н+ ¾® R-OOH + Fе3+
R-OOH + Fe2+ ¾® RO. + .OH + Fe3+
Образующийся Fe3+ даёт цветную реакцию с тиоционатом аммония (роданистым аммонием). Интенсивность окраски тиоционата железа прямо пропорциональна содержанию гидроперекисей липидов.
Ход работы: В две пробирки, №1 и №2, внести по 3,0 мл изопропанола и по 0,5 мл следующих реагентов: 1. Соответствующий безбелковый экстракт сыворотки крови. 2. HCI – 10% р-р. 3. Соль Мора – 0,25% р-р. 4. Тиоционат аммония - 20% р-р.
Полученные смеси фотометрировать на ФЭКе с зеленым светофильтром против воздуха. Содержание гидроперекисей выразить в единицах экстинции и внести в сводную таблицу.
Работа № 2. Исследование содержание МДА.
Принцип метода: Малоновый диальдегид с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) при кипячении образует окрашенный комплекс розового цвета, интенсивность окраски комплекса пропорциональна концентрации МДА.
Ход работы: В чистые стеклянные пробирки №1 и №2 влить по 2,0 мл соответствующего безбелкового экстракта и по 1,0 мл 0,8% р-ра ТБК, перемешать и поместить в кипящую водяную баню на 10 минут. После охлаждения пробирок измерить оптическую плотность каждого раствора на ФЭКе с зеленым светофильтром против воздуха. Содержание МДА выразить в единицах экстинций, результаты внести в сводную таблицу и сделать заключение: по биохимическим анализам, приведенным в сводной таблице, анамнезу и обследованию больного.
Мальчик 12 лет поступил в стационар с жалобами на слабость, приступообразные боли в животе, частый липкий стул. При осмотре на коже спины, плеч и ягодиц обнаружены желтоватые папулы и ксантомы. При пальпации - болезненный живот и увеличенная печень.
Температура тела 37,5ОС. Лабораторное обследование показало – см. табл.
Сводная таблица полученных результатов анализа и дополнительных лабораторных данных.
| Биохим. показатели крови | |||||
| R-OO. ROOH Е | МДА Е | ТГ Ммоль/л | ХС Общ Ммоль/л. | Тест на отстой сыворотки при t + 4 оС | |
| №1 Больной | 15,0 | 6,5 | Сливкообраз- ный слой | ||
| № 2 Здоровый | 1,5 | 5,5 | прозрачная |
Из приведенного ниже перечня диагнозов выберите наиболее соответствующий жалобам больного, данным физикального и лабораторного обследования.
1. Гиперхиломикронемия 2. Гипертриглицеридемия
3. Гиперхолестеринемия 4. Печеночная стеаторея
Клинико-диагностическое значение. Доказано, что кровь и её компоненты отражают состояние ПОЛ в тканях организма. В связи с этим целесообразно изучать показатели ПОЛ в крови для уточнения диагноза заболевания, динамики течения патологического процесса и эффективности его лечения. ПОЛ является одним из ведущих механизмов повреждения клеточных мембран, развития метаболических нарушений и клинических проявлений, в том числе и в выше приведенной патологии.
Дайте краткую оценку вклада ПОЛ в развитие основных симптомов приведенной патологии.
7. Контрольные вопросы по теме занятия (см задание к занятию № 14).
8. Литература для подготовки. (см задание к занятию № 14).
9. Обсуждено на заседании кафедры 29.05.2011 г.
10.Учебное задание подготовлено Трубачевым С.Д.
ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
кафедра биохимии
Утверждаю
Зав. каф. проф., д.м.н.
Мещанинов В.Н.
_____‘’_____________2011 г
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ