Напрями і методи дослідження в біохімії
Тема № 1 Живі системи та їх організація
1. Напрями і методи дослідження в біохімії
2. Хімічний склад тваринного організму
3. Біологічні мембрани
4. Основні поняття і терміни біологічної хімії
НАПРЯМИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ В БІОХІМІЇ
Обмін речовин – основна ознака живого. Основною межею, що відрізняє живу матерію від неживих тіл, є обмін речовин. Ф. Енгельс, визначаючи життя, відзначав: „Життя є спосіб існування білкових тіл, істотним моментом якого є постійний обмін речовин з оточуючою їх зовнішньою природою, причому з припиненням цього обміну речовин припиняється і життя, що приводить до розкладання білка”.
Обмін речовин складається з двох взаємозв'язаних і взаємообумовлених процесів – асиміляція і дисиміляція. Асиміляція – це комплекс фізіологічних і біохімічних перетворень речовин, які поступають в організм, в сполуки, необхідні для його існування. Обмін речовин в тваринному і рослинному організмах має принципові відмінності. Так, рослина будує складові частини свого тіла в процесі фотосинтезу в основному в результаті використання сонячної енергії, води, вуглекислого газу і мінеральних речовин, а людина і тварини одержують речовини рослинного і тваринного походження після їх попереднього розщеплення в травному тракті.
У різних органах, тканинах і клітинах утворюються окремі речовини, необхідні для самозбереження і функціонування живого організму. Ці речовини не є незмінними: в процесі життя вони синтезуються, розпадаються і самооновлюються. При розкладанні цих речовин утворюються шкідливі для організму сполуки, які виводяться з нього як кінцеві продукти обміну. Цей процес називається дисиміляцією.
Біохімічні методи використовуються головним чином для вивчення закономірностей процесів асиміляції і дисиміляції в живих організмах з тим, щоб направлено впливати на ці процеси.
Матеріал для біохімічних досліджень. Біохімічні дослідження проводяться на матеріалі, отриманому від людини, тварин, рослин, мікробів і вірусів. Ним можуть бути продукти життєдіяльності організму, органи, тканини, клітини і субклітинні структури. Матеріал одержують від живих і неживих організмів. Пробами для біохімічних досліджень живих організмів може бути вміст початкових і кінцевих речовин балансових дослідів, ангіостомії, різні біологічні рідини (кров, лімфа, ліквор, травні соки, сеча, химус, піт та ін.), біопсійний матеріал (шматочки органів і тканин, видалених хірургічним шляхом), продукти життєдіяльності організму (молоко, шерсть, середовище існування мікробів) та ін. Проби слід брати швидко, з дотриманням правил асептики і антисептики, етикетувати, після чого піддавати відповідній обробці, яка забезпечувала б максимальне збереження прижиттєвого хімічного складу.
Для біохімічних досліджень твердий матеріал (шматочки органів і тканин) подрібнюється до однорідної кашки (розтиранням в ступці з кварцовим піском) або до гомогенної маси (подрібненням в гомогенізаторах, ультразвуком, осмотичним цитолізом, методом заморожування і відтавання). Подрібнена кашка, гомогенат або біологічні рідини за звичай негайно фіксуються в рідкому кисні, охолоджених сумішах діетилового ефіру, ацетону та ін. Іноді такий матеріал заливають відповідним розчинником, що екстрагує досліджувану речовину або групу речовин. Часто вдаються до озолення матеріалу сухим (обвуглюють, а потім одержують водну або солянокислу витяжки) або мокрим (руйнують окислюючими сумішами) способами. У ряді випадків гомогенати піддають диференціальному центрифугуванню, одержуючи окремі фракції субклітинних структур. Отриманий і підготовлений для біохімічних досліджень матеріал бережуть в певних умовах, передбачених методом, найчастіше при температурі 0 – 4 °C. Зберігання матеріалу не повинно бути тривалим, оскільки з часом його хімічний склад змінюється. В деякі види матеріалу (наприклад, в сечу) для збереження додаються фіксуючі засоби (кристали тимола).
Рівні вивчення обміну речовин. Обмін речовин в живій матерії можна вивчати на різних рівнях, починаючи від організму і кінчаючи атомами. Серед методів вивчення обміну речовин на рівні цілісного організму особливе місце займає метод балансових дослідів, коли в організмі тварини розглядається перетворення речовин, починаючи від складу корму і кінчаючи продуктами кінцевого обміну, які визначаються у видихуваному повітрі, сечі, калі, поті. Цінні дані по обміну речовин в цілісному організмі можна отримати методом колориметрії, який дає можливість визначити енергетичну цінність поживних речовин в звичайних умовах і в умовах досліду. Окремі сторони перетворення речовин в організмі можна вивчити методом визначення дихального коефіцієнта. Багато сторін обміну речовин в організмі вивчають, досліджуючи хімічний склад окремих біологічних рідин (наприклад, за вмістом іонів Ca2+ в сироватці крові можна судити про стан обміну кальцію в організмі).
Матеріал для біохімічних досліджень, який характеризує обмін речовин на рівні окремих органів, одержують при постановці спеціальних дослідів. До них слід віднести метод ангіостомії, розроблений E.С. Лондоном. В кровоносні судини органу вставляють канюлі, за допомогою яких одержують проби артеріальної і венозної крові. При органостомії канюлю вставляють до органу, а після загоєння рани беруть проби для біохімічного аналізу. І.П. Павлов і його учні розробили постановку фістул для більшості органів травлення. Іноді матеріалом для досліджень служать біологічні рідини (кров, лімфа, ліквор, сеча та ін.), отримані від тварин, у яких видалений або був підсаджений орган (найчастіше – залози внутрішньої секреції).
Деякі біохімічні дослідження проводяться на тканинному рівні. Представляє інтерес метод тканинних зрізів, розроблений О. Варбургом. З тканин, тільки що відокремлених від організму, готують тонкі зрізи, які негайно поміщають у відповідні розчини. Через деякий час в зрізах і розчинах вивчають продукти метаболізму. Інкубацію зрізів проводять в замкнутій системі з манометром при температурі 37 оC. Набувають поширення гістохімічні методи, за допомогою яких на препаратах мікроскопічно визначають тканинну локалізацію і вміст окремих речовин.
Матеріалом для біохімічних досліджень можуть служити клітини. Найоб'єктивніші дані по хімічній статиці і динаміці клітин дають кількісні цитохімічні методи, за допомогою яких на препаратах (мазках або відбитках) визначають в окремих клітинах кількість різних хімічних речовин. Цінну інформацію про обмін речовин можна отримати на клітинному рівні, використовуючи метод авторадіографії. Піддослідним тваринам вводять радіоактивні ізотопи, які включаються в реакцію асиміляції. Через деякий час піддослідних тварин вбивають, а з відповідних їх органів або тканин готують гістологічні препарати. Після певної обробки виявляють радіоактивний розпад ізотопів. Метод точний і дозволяє визначити в клітині до 50 – 60 атомів ізотопу.
Інформацію про обмін речовини на субклітинному рівні можна отримати, вивчаючи продукти фракціонування клітинних структур. Спочатку з відповідного матеріалу (шматочків органів або тканин) одержують гомогенат. На спеціальних приладах – ультрацентрифугах – одержують фракції і підфракції, які містять різні субклітинні структури, що і служать матеріалом для біохімічних досліджень.
Методи електронної гісто- і цитохімії дають можливість при збільшенні електронного мікроскопа 1 – 0,1 нм виявляти в субклітинних структурах локалізацію і кількість окремих хімічних речовин.
Комплексне використання методів дозволило розшифрувати ультраструктуру клітини – основного об'єкту дослідження живої матерії.
Виділення досліджуваних речовин з матеріалу. В матеріалі для біохімічного дослідження речовини рідко зустрічаються в чистому вигляді. Для розділення сумішей і виділення речовин у чистому вигляді застосовується ряд методів: перегонка, сублімація, випаровування, мікродифузія, фільтрація в гелях сефадексів, діаліз, кристалізація, екстракція, аналіз седиментації, електрофорез та ін. Багато які з цих методів основані на відмінності температури переходу речовини з одного агрегатного стану в інший, розділенні у зв'язку з неоднаковою величиною молекул або частинок, різної розчинності, різної реакційної здатності сполук, неоднакової швидкості седиментації, відмінності розподілу між рухомою і нерухомою фазами на основі неоднакової розчинності, величини сорбції молекул і електричного заряду, на неоднаковому електричному заряді молекул при певному значенні рН, на відмінності рухливості в електричному і магнітному полі комплексу речовини із зарядженими частинками, розділенні на основі різних імунних властивостей речовин та ін.
Основи методів кількісного аналізу. Методи кількісного аналізу, які використовуються в біохімії, основані на визначенні в тому або іншому субстраті кількості речовини за її екстенсивними властивостями (маса, об'єм) або фізичними, термічними, електричними, ядерними, хімічними, а також по взаємодії речовини з променистою енергією, дифракції рентгенівського проміння і електронів, випуску випромінювання та ін.
Класифікація біохімічних методів. Кількість біохімічних методів, які використовуються у теоретичній і прикладній біохімії, клінічній практиці і суміжних дисциплінах, величезне. Так, наприклад, для виявлення холестерину існує понад 100 біохімічних методів. Є декілька видів класифікацій. Найбільш прийнятна класифікація за способом підходу до визначення вмісту тієї або іншої речовини в субстраті.
Методи об'ємно-вагового аналізу. Принципи об'ємно-вагового аналізу є основою біохімічного дослідження. По кількості речовини в субстраті розрізняють: макрометоди – для аналізу береться 40 – 50 мл розчину або близько 500 мг сухої речовини; напівмікрометоди – об'єм досліджуваного розчину складає від 1 до 100 мл, маса сухої речовини – від 10 до 100 мг; мікрометоди – об'єм досліджуваного розчину – декілька десятих часток мілілітра, маса сухої речовини – декілька міліграмів; ультрамікрометоди – об'єм досліджуваного розчину менше 0,1 мл, маса сухої речовини менше 1 мг.
Об'ємно-ваговий аналіз оснований на кількісному визначенні об'єму або маси досліджуваної речовини. Це визначення проводиться зважуванням (для сухих речовин) або титруванням (для розчинів).
Методи об'ємно-вагового аналізу, основані на титруванні, ділять на чотири групи: ацидометричні, алкаліметричні, оксидометричні і осадження. Для першої групи як титруючий розчин застосовують розчин кислоти, другої – розчин лугу, третьої – окислювачі, четвертої – солі важких металів. Перші дві групи методів називають методами нейтралізації. Методом нейтралізації визначають, наприклад, загальний і залишковий азот по Кьельдалю, оксидометрією визначають цукор крові і т.д.
Кількісний вміст сухої речовини визначається гравіметричним методом. Наважку проби розчиняють, малорозчинний осад промивають, потім висушують або прожарюють до постійного значення маси, а потім визначають її величину. Прикладом може бути визначення маси казеїну в молоці.
Оптичні методиволодіють високою чутливістю (вони виявляють у пробах вміст речовин у концентраціях менше 0,001 мг), специфічністю і точністю. Розрізняють п'ять основних груп оптичних методів: адсорбційні, нефелометричні і турбідиметричні, люмінесцентні, спектральні і поляриметричні.
Адсорбційні методи основані на визначенні кількості речовини в розчинах по інтенсивності поглинання ним світлової енергії. Залежно від використання світлової енергії розрізняють фотометрію і спектрофотометрію. Фотометрія включає власне фотометричні (візуальні і фотоелектроколориметричні) і колориметричні (стандартних серій і шкали, колориметричного титрування, порівняння) методи. Прикладом широкого використання цих методів в лабораторній практиці є визначення фосфору в сироватці крові фотоелектроколориметром по Фіску-Суббароу. Розрізняють три види спектрофотометрії: фотографічну, термоелектричну і фотоелектричну. В біохімії найчастіше використовується фотоелектрична спектрофотометрія, наприклад визначення нуклеїнових кислот спектрофотометрами.
Нефелометричні і турбідиметричні методи (візуальні і об'єктивні) основані на вимірюванні інтенсивності світлового потоку, розсіяного суспензіями окремих речовин. При нефелометрії вимірюється інтенсивність розсіяного світлового потоку в напрямі, перпендикулярному до падаючого світлового потоку. При турбідиметрії вимірюється інтенсивність світлового потоку, який пройшов через кювету з розчином, що вивчається, у напрямі падаючого світлового потоку. Ці методи застосовуються при визначенні в різних розчинах вмісту білків, амінокислот, деяких вітамінів і інших речовин. Наприклад, фотоелектроколориметрами-нефелометрами визначають вміст альбумінів і глобулінів в сироватці крові.
Люмінесцентний аналіз володіє високою чутливістю (від 0,0001 до 1000 мкг), специфічністю виявлення мінімальних кількостей речовин, яскравістю і контрастністю. Він оснований на здатності окремих речовин спочатку поглинати, а потім випромінювати світлову енергію. Деякі речовини володіють власною (первинною) люмінесценцією (вітаміни групи А, ліпофусцин, амілоїди, бензопірен). У інших сполук ця властивість виникає після обробки їх флуорохромами (вторинна люмінесценція). Метод використовується для визначення вмісту вітаміну В1 в сечі електронним флуориметром по Вангу і Харрісу та ін.
Спектральний аналіз дає можливість вивчати якісний і кількісний склад молекул і атомів різних речовин на основі визначення спектрів поглинання або випускання світлової енергії. Розрізняють декілька видів спектрального аналізу – емісійний, адсорбційний і комбінаційний. У клініці широко застосовується полум’яно-фотометричний метод визначення натрію, калію і кальцію в сироватці крові по Габшу.
Поляриметричний аналіз оснований на здатності оптично активних речовин в розчині обертати площину поляризованого світла. У складі молекули такої речовини є асиметричні атоми вуглецю. Як приклад назвемо визначення вмісту глюкози в сечі поляриметром або глюкозиметром.
Хроматографічні методи. Найчастіше використовуються як попередні методи біохімічного аналізу. Так, цими методами з різних сумішей виділяють речовини в чистому вигляді, а потім іншими методами (головним чином, об'ємно-ваговими і оптичними) визначають їх кількісний вміст. Методи були розроблені і введені російським ботаніком M.С. Цветом у 1903 р.
Залежно від середовища, де проводиться розділення, розрізняють газову, газорідинну і рідинну хроматографію; залежно від механізму розділення – адсорбційну (молекулярну), розподільну, іонообмінну, осадову, окисно-відновну, адсорбційно-комплексоутворюючу; залежно від методу проведення – колоночну, капілярну, площинну (паперову і в тонкому шарі); залежно від мети дослідження – аналітичну, препаративну і промислову. Методи хроматографії часто застосовують спільно з методами електрофореза для виділення і очищення різних речовин з сумішей (наприклад, якісне і кількісне визначення амінокислот в сироватці крові за допомогою хроматографії).
Методи електрофореза. Застосовуються для розділення білків на окремі фракції (альбуміни, α-, β-, γ-глобуліни) і підфракції, а також для виділення ізоферментів та інших речовин з біологічних рідин і штучних розчинів. Розрізняють препаративний і кількісний електрофорез. Препаративний електрофорез застосовується для розділення сумішей речовин в газовому і рідкому середовищах. Кількісний електрофорез використовується для визначення кількості речовин після їх розділення. В біохімічних дослідженнях часто використовуються зональний фронтальний (або вільний) електрофорез, мікроскопічний та імуноелектрофорез. Залежно від природи носія зональний електрофорез може проводитися на папері, в гелях, в блоках і т.д. В клініці часто проводиться електрофоретичне визначення білкових фракцій сироватки крові на папері. У ряді випадків застосовується універсальний прилад для імуноелектрофореза і електрофореза білків (УЕФ), за допомогою якого білки розділяють на агар-агарі, папері, крохмалі, проводячи потім їх кількісне визначення.
Методи полярографії. Це група електрохімічних методів, основаних на явищі дифузійного струму, величина якого пропорційна концентрації речовини, що обумовлює цей струм. Розрізняють постійнострумову, зміннострумову, високочастотну, імпульсну і осцилографічну полярографію. Методи використовуються для ранньої діагностики хвороб серцево-судинної системи, визначення вмісту в тканинах кисню і мікроелементів, оцінки якості м'яса та ін. В клініці застосовується полярографічний метод визначення вмісту фосфору в сироватці крові (за M.О. Кондрашовою).
Манометрові методи. Основані на вимірюванні тиску рідин або газів манометрами. Використовується для вимірювання тиску газів (найчастіше CO2 і O2) під час їх поглинання або утворення при постійній температурі і об'ємі в закритій системі. Застосовуються при вивченні тканинного обміну, різних видів бродіння, дослідженні газообміну між кров'ю і тканинами, визначенні ряду продуктів проміжного обміну, амінокислот, активності окремих ферментативних систем і т.д. Прикладом може бути метод визначення окислювального фосфорилування по Варбургу.
Інші методи біохімічних досліджень. Окрім розглянутих, в біохімії застосовуються методи ультрацентрифугування і радіоактивних ізотопів. В першому випадку використовуються ультрацентрифуги, що дають від 20000 до 200000 об/хв. Методи ділять на декілька видів: визначення швидкості седиментації, рівноваги седиментації і метод диференційного центрифугування. Вони дають можливість отримати окремі фракції і підфракції клітин і тканин, хімічний склад яких вивчається різноманітними методами об'ємно-вагового, оптичного, полярографічного і інших аналізів.
При використанні методу радіоактивних ізотопів піддослідній тварині ін'єкцією або з кормом вводиться мічений попередник, після чого він включається в реакції обміну речовин.
Радіоактивний розпад мічених атомів потім уловлюється радіометрами. В лабораторній практиці застосовується метод визначення оновлення фосфору білків.
Статистична обробка результатів біохімічних досліджень. Цифрові дані, отримані різними біохімічними методами, піддаються статистичній обробці. Така обробка дозволяє об'єктивно оцінити результати досліджень. Існує ряд методів статистичної обробки, які приводяться в керівництві по використанню біохімічних методів. Після статистичної обробки приступають до узагальнення результатів біохімічних досліджень. Узагальнення відображаються в таблицях, графіках, діаграмах і інших матеріалах. На підставі цього формулюються висновки про закономірності явищ, що вивчаються, – біохімічній статиці і динаміці живих організмів.