Брандберга-Робертса-Стольникова.
Клинико-диагностическое значение.В норме моча не содержит белка в количестве, обнаруживаемом обычными химическими методами. Белок в моче появляется при заболеваниях почек, при нарушении белкового состава крови.
Принцип метода. В основе метода лежит проба Геллера – денатурация белка азотной кислотой. Экспериментально установлено, что при наслаивании на азотную кислоту, растворы, содержащие 0,0033% белка, дают белое колечко в промежутке между второй и третьей минутами после наслаивания. Если колечко появляется непосредственно после наслаивания раствора белка на азотную кислоту, то путем последовательного разведения исследуемого материала достигают такого максимального разведения, при котором появляется кольцо между второй и третьей минутами. Умножая разведение на 0,0033%, получается процентное содержание белка в моче.
Ход работы.Приготовить 2 ряда пробирок (по 8 в каждом). Во все пробирки первого ряда прилить по 1 мл концентрированной азотной кислоты.
В пробирках второго ряда развести исследуемую мочу методом кратных разведений. Для этого в первую пробирку и вторую пробирки этого ряда налить по 1 мл исследуемой мочи, во вторую и все последующие - по 1 мл дистиллированной воды.
После перемешивания из второй пробирки перенести 1мл жидкости в третью, затем после перемешивания такой же объем из третей пробирки перенести в четвертую и т.д. до конца ряда. Из последней пробирки 1мл жидкости вылить. Таким образом, получается следующий ряд разведений исследуемой мочи: в первой пробирке моча исходной концентрации, во 2-ой – разведена в 2 раза, в 3-ей – в 4 раза, в 4-ой – в 8 раз, в 5-ой - в 16, в 6-ой - в 32, в 7-ой – в 64, в 8-ой – в 128.
После разведения мочи произвести поочередное наслаивание содержимого каждой пробирки на концентрированную азотную кислоту. По секундомеру отметить, в какой пробирке белое кольцо образовалось через 2-3 минуты после начала опыта.
Примерный расчет. Между 2-ой и 3-ей минутами белое кольцо образовалось в 5-ой пробирке, где разведение мочи 1:16.
Следовательно, концентрация белка в исходной порции мочи равна:
0,0033% × 16 = 0,05%
9. Поставить опыт с целью установить специфичность и термолабильносгъ слюны, влияния активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.
Специфичность ферментов.
Одно из более характерных свойств ферментов - их высокая специфичность. Ферменты специфичны как в отношении типа катализируемых реакций, так и в отношении субстратов, на которые они воздействуют. Большинство ферментов обладает абсолютной специфичностью, действуя только на какой-либо один субстрат. Высокая специфичность ферментов определяется соответствием пространственной конфигурации активного центра фермента и субстрата.
Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов (таких как крахмал, гликоген) до мальтозы, но не оказывает действие на дисахариды.
Гидролиз крахмала под влиянием ферментов слюны идет согласно схеме:
Гидролиз крахмала под действием амилазы проходит через стадию образования декстринов. Крахмал дает с йодом синее окрашивание, амилодекстрины («осколки», образующиеся после гидролиза некоторых внутренних гликозидных связей)- фиолетовое, эритро- и ахродекстрины (олигосахариды с меньшей молекулярной массой) – соответственно красно-бурое и желтое (цвет йода в воде). Конечные продукты гидролиза – мальтоза и глюкоза – имеют свободные альдегидные группы и дают реакцию Троммера, которая основана на способности углеводов при нагревании восстанавливать гидрат окиси меди (голубого цвета) в гидрат закиси (желтого цвета). При дальнейшем нагревании гидрата закиси переходит в красную закись меди.
О расщеплении крахмала можно судить на основании двух реакций:
1) реакции на крахмал с йодом и 2) реакции Троммера.
Сахароза не имеет свободной €альдегидной или кетонной группы, поэтому не дает реакции Троммера. Реакция Троммера может быть положительной только в том случае, если сахароза расщепится на свои составные части – глюкозу и фруктозу.
Порядок выполнения работы
Споласкивают рот, в чистую пробирку собирают 2-3 мл слюны, которую разводят в 5 раз.
В две пронумерованные пробирки приливают по 5 капель разведенной слюны. В 1 пробирку добавляют 10 капель 1% раствора крахмала, во 2- 10 капель 1% раствора сахарозы. Обе пробирки помещают на 10 минут в термостат или водную баню при температуре 38оС, после чего содержимое пробирок делят на 2 части, с одной проделывают реакцию на крахмал, с другой реакцию Троммера.