Практическое занятие № 11 (контрольное)

Лабораторно-практические работы.

3.1.Выделить ферменты из биологического материала.

ПОЛУЧЕНИЕ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ АМИЛАЗЫ.

2-3 ложечки высушенной поджелудочной железы растирают в ступке с добавлением 25 мл дистил. воды. Полученная масса настаивается в течение 10-15 минут, затем фильтруется. Фильтрат используется как ферментативный раствор.

ПОЛУЧЕНИЕ САХАРАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ.

2-3 ложечки сухих пекарских дрожжей растирают в течение 5-7 минут с постепенным добавлением 25 мл дистил. воды. Полученная масса фильтруется. Фильтрат используется как ферментативный раствор.

3.2.Выяснить влияние рН среды на активность фермента

МЕТОДИКА ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВЛИЯНИЯ РН СРЕДЫ

НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ.

В три пронумерованные пробирки вносят по 2 мл фосфатного буфера с различным значением рН (5,59; 6,81; 8,04). Приготовление буферного раствора:

pН Na₂HPO₄ KH₂PO₄

----------------- --------------------- ----------------

5,59 0,5мл. 9,5мл

6,81 5,0мл. 5,0мл.

8,04 9,5мл. 0,5мл.

Затем в пробирки добавляют по 1мл 1% р-ра крахмала и по 0,5 мл разбавленного (1:10) р-ра слюны и ставят их в водяную баню при температуре 37^оС на 10 минут. Каждую минуту из 2-й пробирки берут каплю жидкости и смешивают с каплей р-ра йода на предметном стекле. Это повторяют до тех пор, пока проба из 2-й пробирки даст красно-бурое окрашивание. Через 1-2 минуты после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода.

Практическое занятие № 10.

Задание к занятию № 10.

Тема: ферменты.

Учебные и воспитательные цели:

- Общая цель занятия: научить использовать знания о строении ферментов, регуляции их активности, изоферментах, иммобилизованных ферментах в практической деятельности врача.

- Частные цели занятия: уметь определять активность амилазы слюны, влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов.

1. Входной контроль знаний

1.1. Тесты

1.2. Устный опрос

2. Основные вопросы темы.

2.1.Строение простых и сложных ферментов (на примере гидролаз, дегидрогеназ).

2.2.Понятие о каталитическом (активном) и регуляторном (аллостерическом) центрах ферментов.

2.3.Активаторы и ингибиторы ферментов, механизмы их влияния и значение.

2.4.Аллостерическая регуляция активности ферментов (регуляция по типу обратной связи).

2.5. Изоферменты, иммобилизованные ферменты, значение в медицине.

Лабораторно-практические работы.

3.1. Определить активность амилазы слюны.

3.2. Выяснить влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов.

Выходной контроль.

4.1. Тесты

4.2. Ситуационные задачи.

5. Литература.

5.1. Материалы лекций.

5.2. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: «Высшая школа», 1989, с.61-70, 78-81, 84-92.

5.3.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: «Медицина», 1990, с. 97-108, 115-124, 129-131.

5.4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: «Медицина», 2004, с. 120-129, 143-157, 163-165.

5.5. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М.: Медицина, 1983, раб 28, 24 (п. 3).

2. Основные вопросы темы.

2.1.Строение простых и сложных ферментов (на примере гидролаз, дегидрогеназ).

По составу ферменты делятся на простые и сложные.

Простые ферменты состоят из аминокислот. К ним относятся ферменты желудочно-кишечного тракта – α-амилаза, пепсин, трипсин, липаза и др. Все эти ферменты относятся к 3 классу – гидролаз.

Сложные ферменты состоят из белковой части – апофермента и небелковой – кофактора. Каталитически активный комплекс «фермент – кофактор» называется холоферментом. В качестве кофакторов могут выступать как ионы металлов, так и органические соединения, многие из которых являются производными витаминов.

Например, оксидоредуктазы используют в качестве кофакторов Fe²+, Сu²+, Mn²+, киназы Mg²+; для глутатионпероксидазы – фермента, обезвреживающего перекись водорода, требуется селен.

Коферменты – это органические вещества, которые непрочно связаны с белковой частью. Например, НАД-зависимые дегидрогеназы состоят из белка и коферментов НАД, НАДФ, производных витамина РР.

Простетическая группа – это коферменты, которые прочно (часто ковалентно) связаны с апоферментом. Например, флавиновые дегидрогеназы состоят из белка и простетических групп ФАД, ФМН, производных витамина В₂. Апофермент определяет направленность или специфичность действия фермента.

2.2.Понятие о каталитическом (активном) и регуляторном (аллостерическом) центрах ферментов.

Активный центр – это относительно небольшой участок, расположенный в узком гидрофобном углублении (щели) поверхности молекулы фермента, непосредственно участвующий в катализе. Активный центр – это точная пространственная организация больших ансамблей, построенных из аминокислотных остатков: серин – ОН группа; цистеин – SH группа; лизин – NH2 группа; гистидин – имидазольное кольцо; глутаминовая, аспарагиновая кислоты – СООН группа.

По первичной структуре эти аминокислотные остатки располагаются на различном расстоянии друг от друга, при образовании вторичной, третичной структур аминокислотные остатки сближаются, формируя активный центр.

Активный центр включает субстратсвязывающий участок, который отвечает за специфическое комплементарное связывание субстрата, и каталитический участок непосредственного химического взаимодействия.

В активный центр сложных ферментов входит участок для связывания кофактора. Регуляторные (аллостерические) ферменты помимо активного центра имеют аллостерический центр. К аллостерическому центру могут присоединяться гормоны или продукты реакции. Это приводит к изменению структуры активного центра. Эти вещества называются аллостерическими эффекторами (модификаторами). Эффекторы могут быть положительными (усиливают действие фермента) и отрицательными (блокируют действие фермента).

2.3.Активаторы и ингибиторы ферментов, механизмы их влияния и значение.

На скорость химических реакций оказывают влияние различные вещества. По характеру влияния вещества подразделяются на активаторы, увеличивающие активность ферментов, и ингибиторы (парализаторы), подавляющие активность ферментов.

Активирование ферментов могут вызывать:

1. Присутствие кофакторов – ионы металлов Fe²+, Mg²+, Mn²+, Cu²+, Zn²+, АТФ, липоевая кислота.

2. Частичный их протеолиз.

Ферменты желудочно-кишечного тракта вырабатываются в виде неактивных форм – зимогенов. Под влиянием различных факторов происходит отщепление пептида с формированием активного центра и зимоген превращается в активную форму фермента.

Пепсиноген НСl пепсин + пептид

Трипсиноген энтерокиназа трипсин + пептид

Этот вид активирования предохраняет клетки желудочно-кишечного тракта от самопереваривания.

3. Фосфорилирование и дефосфорилирование. Например:

неакт. липаза + АТФ → липаза-фосфат (акт. липаза);

липаза-фосфат+Н3РО4 → липаза (неакт. липаза)

Ингибиторы по характеру своего действия подразделяются на обратимые и необратимые. В основе такого деления лежит прочность соединения ингибитора с ферментом.

Обратимые ингибиторы – это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом и могут отщепляться от фермента.

Необратимые ингибиторы – это соединения, которые образуют ковалентные, прочные связи с ферментом.

Необратимое ингибирование может быть специфическим и неспецифическим.

При специфическом ингибировании ингибиторы тормозят действие определенных ферментов, связывая отдельные функциональные группы активного центра. Например, тиоловые яды ингибируют ферменты, в активный центр которых входят SН-группы; угарный газ (СО) ингибирует ферменты, имеющие в активном центре Fe²+.

Неспецифические ингибиторы тормозят действие всех ферментов. К ним относятся все денатурирующие факторы (высокая температура, органические и минеральные кислоты, соли тяжелых металлов и др.).

Обратимое ингибирование может быть конкурентным. При этом ингибитор является структурным аналогом субстрата и конкурирует с ним за связывание в субстратсвязывающем участке активного центра.

Отличительная особенность конкурентного ингибирования состоит в том, что его можно ослабить или полностью устранить, повысив концентрацию субстрата.

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) – фермент цитратного цикла, дегидрирует сукцинат, превращая его в фумарат. Малонат, который структурно похож на сукцинат, связывается в активном центре СДГ, но не может дегидрироваться. Поэтому малонат – конкурентный ингибитор СДГ.

Многие лекарственные препараты являются конкурентными ингибиторами ферментов. Например, сульфаниламидные препараты, являясь структурными аналогами парааминобензойной кислоты (ПАБК) – основного фактора роста болезнетворных микроорганизмов, конкурируют с ней за связывание в субстратсвязывающем участке активного центра фермента. На этом основано противомикробное действие сульфаниламидных препаратов.

2.4.Аллостерическая регуляция активности ферментов (регуляция по типу обратной связи).

Регуляция по типу обратной связи (аллостерическая регуляция активсти ферментов).

В некоторых многоступенчатых метаболических путях конечный продукт ингибирует регуляторный (аллостерический) фермент процесса.

При повышении концентрации продукта реакции „Z” он занимает аллостерический центр регуляторного фермента „Е₁”. Это приводит к изменению конформации активного центра „Е₁”, в результате чего фермент „Е₁” ингибируется и не может соединиться с субстратом „А”. Эта регуляция обеспечивает адаптацию организма к изменяющимся условиям. Например,

Треонин Е₁ x Е₂ y Е₃ n изолейцин

2.5. Изоферменты, иммобилизованные ферменты, значение в медицине.

Изоферменты – это множественные формы одного и того же фермента. Изоферменты катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по аминокислотному составу и некоторым физико-химическим свойствам (молекулярной массе, электрофоретической подвижности и др.). Например, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ) существует в пяти формах: ЛДГ₁, ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄, ЛДГ₅.

ЛДГ катализирует реакцию:

Глюкоза

ЛДГ _4,5

ПВК молочная кислота + 2 АТФ

ЛДГ _1,2

СО2 + Н2О + 38 АТФ

Каждая ткань имеет определенный изоферментный спектр ЛДГ: в сердечной мышце – ЛДГ_1,2; в печени, скелетных мышцах – ЛДГ_4,5.

Какова целесообразность синтеза фермента в нескольких молекулярных формах? В тканях с преимущественно аэробным обменом веществ (сердечная мышца), преобладают формы ЛДГ_1,2, которые обеспечивают ткани большим количеством энергии. В тканях с преимущественно анаэробным обменом веществ (печень, скелетные мышцы) преобладают ЛДГ_4,5, что приводит к образованию молочной кислоты и двух молекул АТФ.

Определение уровня активности изоферментов в сыворотке крови имеет важное значение в диагностике заболеваний. например, повышение активности ЛДГ1,2 наблюдается при инфаркте миокарда; ЛДГ_4,5 – при заболеваниях печени (гепатит, цирроз).

Иммобилизованные ферменты.

Практическое использование ферментов столкнулось с большими трудностями. Первое – это сложность и дороговизна получения достаточных количеств ферментов в чистом виде. Кроме того, ферменты быстро теряют свою активность под действием различных факторов (изменение кислотности среды, температуры, солевого состава и др.)

При использовании ферментов возникают осложнения, в первую очередь иммунологические. Также невозможно создать высокую местную концентрацию фермента при локальных поражениях, так как ферменты не обладают способностью к «направленному транспорту».

Группой под руководством отечественного ученого И. Березина впервые были созданы иммобилизованные ферменты.

Под иммобилизацией ферментов понимают их физическое (адсорбционное) или химическое (ковалентное) связывание с матрицей носителя, которая защищает фермент от инактивирующих воздействий, но в минимальной степени влияет на функционирование его активных центров. Материалом для изготовления носителя могут служить неорганические пористые стекла, силикагели, а также природные или синтетические полимеры.

Разработаны несколько видов иммобилизации.

Наиболее распространены реакции ацилирования, в которые могут вступать амино-окси- и некоторые другие группы белка, при этом чаще всего реакция протекает по аминогруппам лизиновых остатков.

Очень распространена реакция образования азаметиновой связи (оснований Шиффа) между альдегидными группами носителя и аминогруппами белка.

Относительно новый способ получения устойчивых терапевтических ферментов – иммобилизация на соединениях, характерных для самого организма или даже обладающих собственной биологической активностью, дополняющих или усиливающих действие связанного с ними фермента. Примером может служить фибринолизин, иммобилизованный на гепарине, урокиназа – на альбумине.

Наконец, растворимые препараты иммобилизованных ферментов медицинского назначения могут быть получены путем их межмолекулярного слияния. Например, слияние молекул галактозидазы обеспечивает стабилизацию фермента. Одновременно замедляется переваривание фермента и увеличивается время его нахождения в кровотоке.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ. Они обладают достаточно длительным сроком годности, у них снижена аллергичность и иммуногенность за счет частичной или полной блокады антигенных участков белка макромолекулой носителя, они слабо восприимчивы к действию естественных ингибиторов и проявляют терапевтическую активность в течение длительного времени. Носитель, с которым связан фермент, обеспечивает не только устойчивость, но и направленную доставку фермента предпочтительно в зону поражения, т.е. в определенный орган или ткань.

Область применения иммобилизованных ферментов очень широка. Они могут быть компонентами аналитических систем для клинического биохимического анализа, могут служить для модификации внутренних поверхностей, как различного рода протезов, так и медицинских аппаратов, могут являться компонентами перевязочных и дренирующих материалов, обеспечивающих ускорение заживления и очищения ран.

Если фермент служит для лечения местных поражений (опухолей, тромбов) и его присутствие в других органах нежелательно, то создаются биосовместимые и биоразлагаемые производные ферментов в виде микрочастиц, гранул, таблеток.

Некоторые иммобилизованные ферменты используются для наружного применения, при включении в состав различных мазей или кремов.

Практическое занятие № 11 (контрольное).

Задание к занятию № 11.

Тема: ФЕРМЕНТЫ.

Цель занятия:

- контроль приобретенных знаний.

Основные вопросы темы.

1.Что такое ферменты, биологическая роль в детском организме?

2.Номенклатура и классификация ферментов.

3.Значение определения активности ферментов в диагнозе и прогнозе заболеваний.

4.Применение ферментов в качестве лечебных препаратов.

5.Энзимопатии.

6.Химическая природа ферментов.

7.Строение простых и сложных ферментов.

8.Понятие об активном центре ферментов.

9.Механизм действия ферментов.

10.Свойство ферментов как биологических катализаторов: термолабильность, влияние рН среды, специфичность.

11.Механизмы активирования ферментов. Проферменты, физиологическое значение образования их.

12.Ингибиторы ферментов: специфические и неспецифические.

13.Конкурентное торможение, значение в изыскании лекарственных препаратов.

14.Аллостерические (регуляторные) ферменты.

15.Регуляция по типу обратной связи (ретроингибирование).

16.Изоферменты, механизм образования, биологическая роль.

17.Иммобилизованные ферменты, значение в медицине.

18.Связь витаминов с ферментами.

19.Терапевтический эффект применения сульфаниламидных препаратов.