Общеклиническое исследование ликвора
Реакция ликвора. рН в норме слабощелочная (рН в пределах 7,4–7,5). Определение реакции СМЖ проводят с помощью тест-систем. Тестовое поле для определения рН содержит метиловый красный и бромтимоловый синий, а реагентная зона полосок содержит кислотно-щелочной индикатор бромтимоловый синий. Это обеспечивает различимое сочетание окраски от оранжевого через зеленый до синего при изменении рН в диапазоне 5–9.
Каплю ликвора пипеткой наносят на реагентную зону. Оценка теста должна проводиться немедленно. При кровоизлиянии в мозг рН ликвора в норме или слабо кислая, особенно у больных с тяжелой формой, а при субарахноидальном кровоизлиянии рН ликвора становится кислой.
Относительная плотность ликвора.Определение плотности проводят ареометром малого размера. Наиболее простым и доступным способом является использование диагностических полосок различных производителей, содержащих тестовую зону для определения относительной плотности. Повышение относительной плотности наблюдается при травмах головного мозга, менингитах (до 1,012–1,015), уремии, сахарном диабете и др. Уменьшается плотность при гидроцефалии, обусловленной гиперпродукцией СМЖ.
Относительная плотность ликвора (ОПЛ).Определение ОПЛ проводят ареометром малого размера. Наиболее простым и доступным способом является использование диагностических полосок различных производителей, содержащих тестовую зону для определения относительной плотности. Повышение ОПЛ наблюдается при травмах головного мозга, менингитах (до 1,012–1,015), уремии, сахарном диабете и др. Уменьшается ОПЛ при гидроцефалии, обусловленной гиперпродукцией СМЖ. Нормальные значения относительной плотности для люмбального ликвора 1,005-1,009, для субокципитального – 1,003-1,007, для вентрикулярного 1,002-1,004.
Определение глобулинов методом высаливания (реакция Нонне-Апельта). Реакция основана на свойстве солей в определенной концентрации избирательно осаждать глобулины.
Готовится насыщенный раствор сульфата аммония х.ч.: 85 г соли растворяют в 100 мл воды при кипячении. Полученный раствор выдерживают 48 ч при комнатной температуре, фильтруют и используют для постановки реакции. рН раствора нейтральная 7,0–7,1. В случае кислой реакции его подщелачивают крепким раствором аммиака.
В пробирку вносят 0,5 мл ликвора, приливают 0,5 мл реактива и перемешивают (опыт). В контрольную пробирку равного диаметра наливают 1 мл воды (контроль). М.А. Базарнова и В.Т. Морозова (1988) советуют наливать в пробирку 0,25–1,0 мл насыщенного сульфата аммония (в зависимости от количества ликвора) и осторожно наслаивать на него равный объем ликвора. При положительной реакции на месте соприкосновения появляется беловатое кольцо. Результат определяют через 2–3 минуты.
Заметив наличие кольца, пробирку встряхивают и оценивают степень образования мути. Регистрацию результатов реакции производят в течение 3 мин после смешивания ликвора с реактивом, так как в последующем помутнение может произойти и в нормальной СМЖ. Сравнение опыта с контролем производят на темном фоне. Для выражения результатов пользуются системой 4 плюсов:
Ø значительное помутнение 4 (++++);
Ø умеренное 3 (+++);
Ø заметная опалесценция 2 (++);
Ø слабая опалесценция 1 (+);
Реакция дает относительное представление о нормальном и патологическом содержании глобулинов в ликворе.
Слабую опалесценцию иногда находят и в нормальной спинномозговой жидкости при небольшом повышении содержания общего белка (больше 0,2 г/л). Наиболее достоверное представление о содержании глобулинов и их фракций можно получить при электрофоретическом исследовании ликвора, которое целесообразно проводить при положительной реакции Нонне–Апельта.
Определение глобулинов реакцией Панди. Реакция основана на осаждении глобулинов насыщенным раствором карболовой кислоты.
Готовится насыщенный раствор карболовой кислоты: 100 г карболовой кислоты растворяют в 1 л воды, встряхивают и оставляют в термостате при 37°С на 6—8 ч. После пребывания при комнатной температуре в течение 7 дней надосадочную жидкость сливают и используют в качестве реактива.
На часовое стекло, помещенное на черную бумагу, наливают 1 мл реактива и по краю наслаивают 1–2 капли ликвора. В случае положительного результата в месте соприкосновения реактива с СМЖ образуется молочно-белое облачко, переходящее в муть. Для обозначения результатов реакции Панди пользуются системой четырех плюсов:
Ø значительное помутнение 4 (++++);
Ø умеренное 3 (+++);
Ø заметная опалесценция 2 (++);
Ø слабая опалесценция 1 (+).
Реакция Панди осаждает такие белковые фракции, которые остаются неосажденными в реакции Нонне—Апельта, поэтому целесообразно ставить обе реакции одновременно.
Определение белка полуколичественным методом (с помощью тест-систем). Диагностические полоски можно использовать в качестве ориентировочного метода определения белка ликвора, так как эти тест-системы позволяют определить практически только альбумин (АльбуФАН, Урискан, Урибел). Индикатор бромтимоловый синий в присутствии альбумина меняет исходно желтоватый цвет на бледно-зеленый, насыщенно-зеленый или темно-зеленый в зависимости от содержания альбумина в ликворе.
Для проведения анализа тест-полоску погружают в ликвор до отмеченной линии строго на тот временной промежуток, который указан производителем в инструкции (для теста АльбуФАН он составляет 2-3 секунды). Излишки жидкости удаляют постукиванием ребра полоски о край пробирки. Результат считывают спустя 45-60 секунд в помещении с температурой воздуха от +15 до +30 градусов С. Цвет индикаторной зоны сравнивают с цветами, указанными на тубе с тест-полосками, он меняется в зависимости от концентрации альбумина в ликворе. Через 5 минут от проведения исследования результаты считаются недостоверными и считывать их нельзя.
Реагентные зоны соответствуют концентрации альбумина: 0,15, 0,3, 1,0; 3,0 и ≥10,0 г/л. Если цвет реактивной зоны оказывается между цветами двух соседних этикеток, то результат определяется по наиболее близкой цветной зоне шкалы.
Определение белка фотоколориметрическим методом (Белур 600). Метод основан на изменении оптической плотности ликвора после добавления в него реагента, связывающего белок (пиррагололового красного, сульфосалициловой кислоты, бриллиантового синего). Учет реакции проводится при помощи аппарата Белур 600 – миниатюрного и простого в эксплуатации фотоколориметра. В него помещают прозрачную кювету с реакционной смесью, через которую аппарат пропускает оранжевый свет с длиной волны 600 нм. С противоположной стороны световые волны воспринимает фотоэлемент, таким образом определяется количество поглощенного раствором волн света. Существует прямая связь между количеством белка и изменением оптической плотности раствора, по которой аппарат расчитывает концентрацию общего белка в растворе.
Реакция Фридмана–Ференца.Используется для ранней диагностики менингита.
Метод основан на окислительно-восстановительной реакции раствора перманганата калия и осаждении белка трихлоруксусной кислотой.
Реактивы:
1.1% водный раствор перманганата калия, приготовленный на бидистиллированной воде и постоявший не менее 2–3 недель;
2.20 % раствор трихлоруксусной кислоты х.ч.
К 1 мл СМЖ прибавляют 0,05 мл (1 каплю) реактива 1, смесь хорошо взбалтывают. В нормальном ликворе наблюдается яркое фиолетовое окрашивание, которое долго сохраняется. Цвет не меняется от прибавления 2–3 капель реактива 2.
В ранней стадии менингита при смешивании ликвора с раствором перманганата калия фиолетовый цвет очень быстро (в течение 1–2 мин) переходит в красно-желтый и коричнево-желтый цвет. При добавлении трихлоруксусной кислоты (реактив 2) в случаях гнойного менингита цвет доходит до светло-желтого или наступает полное обесцвечивание с одновременным помутнением и осаждением белка. Изменения цвета по описанному типу не наступает при других органических поражениях мозга: травме, опухолях мозга, сифилисе мозга, рассеянном склерозе, протекающих без менингеальных симптомов.
Метод относится к качественным реакциям. В настоящее время постановка реакции Фридмана–Ференца нецелесообразна в КДЛ, поскольку основной реактив перманганат калия включен в список препаратов ограниченного использования.
Метод определения белка с сульфосалициловой кислотой. Интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой пропорциональна его концентрации.
Реактивы:
1. 6% раствор сульфосалициловой кислоты (ССК).
2. 14% раствор безводного сульфата натрия.
Для анализа применяют свежеприготовленную смесь равных объемов этих реактивов (рабочий раствор)
3. Стандартный раствор альбумина – 1 % раствор: 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9% раствора хлорида натрия в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствором хлорида натрия до метки. Реактив нестойкий. Для стабилизации к стандартному раствору прибавляют 1 мл 5% раствора азида натрия (NaN3) В этом случае при хранении в холодильнике реактив годен к употреблению в течение 2 мес. 1 мл раствора содержит 10 мг альбумина
4. 0,9% раствор хлорида натрия.
Для учета результата реакции использую фотоколориметр.
В пробирку наливают 5 мл свежеприготовленного рабочего раствора и 0,5 мл ликвора. Тщательно перемешивают. Через 10 мин интенсивность помутнения измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 1 см против контроля, длина волны 410–480 нм (сине-фиолетовый светофильтр). В контроль вместо реактива берут 0,9% раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику.
Недостатками метода при определении белка в СМЖ сульфосалициловым методом являются:
Ø низкая устойчивость комплекса, образующегося при взаимодействии белка с ССК;
Ø сложная, нелинейная зависимость оптической плотности реакционной смеси от концентрации белка;
Ø влияние лекарственных веществ на результаты анализа, так искажение результатов может быть следствием приема препаратов аспирина, хлорпромазина, имипрамина, лидокаина, метицилина, метотрексата, морфина, пенициллина, фенацетина, прокаина, стрептомицина, тирозина, ибупрофена, сулиндака;
Ø неполная преципитация ряда белков анализируемой пробы, приводящая к заниженному результату определения общего белка;
Ø обязательно построение калибровочного графика, так как использование расчетных коэффициентов невозможно, в связи с тем, что зависимость оптической плотности от концентрации белка не является прямопропорциональной.
Перед опытом целесообразно поставить реакцию Панди (качественная проба на белок), и если результат реакции оценивают 3+ или 4+, то перед количественным исследованием ликвор надо развести изотоническим раствором хлорида натрия и при расчете учесть степень разведения. Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 0,6 г/л, поэтому при более высоких концентрациях белка ликвор следует разводить.
Обязательно колориметрировать опытную пробу против холостой, так как выраженная окраска СМЖ может приводить к ошибкам при определении концентрации белка (завышение результатов) при колориметрии против воды. Если муть начинает оседать, перед измерением на фотоэлектроколориметре пробирку следует тщательно встряхнуть.