A-амилазы слюны (термолабильность ферментов)
Активность ферментов зависит от температуры. Та температура, при которой активность фермента наибольшая, называется температурным оптимумом (opt-t°). Для организма человека opt-t° находится в пределах 37-40°С. Снижение t° приводит к уменьшению активности ферментов, и при очень низких температурах (О° - +4°С) ферментативная активность практически прекращается, т.к. резко изменяются кинетические свойства ферментов. Поэтому снижение активности ферментов имеет обратимый характер: при повышении температуры ферментативная активность полностью восстанавливается.
Повышение t выше opt-t° приводит к постепенному снижению активности и при достижении определенной t для каждого фермента – к полной инактивации фермента, которая является необратимой. При t - 60°С, (для некоторых 70-100°С) происходит денатурация белка-фермента, разрушение активного центра фермента, образование Е-S-комплекса становится невозможным, и ферментативная реакция прекращается.
( На термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация S, рН среды и др. факторы.)
Ход работы
В 4 пробирки отмерить по 4 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл слюны, разведенной в 10 раз. Пробирку 1 поместить в кипящую баню, 2 пробирку в ледяную баню, пробирку 3 –в термостат при температуре 38°С, пробирку 4 оставить при комнатной температуре.Через 10 минут содержимое каждой пробирки разделить на 2 части и провести пробу Фелинга, а с другой частью –пробу Люголя.
Реакция Люголя. Реакция обнаруживает крахмал. К содержимому пробирки добавить 1 каплю раствора Люголя. Появление синего окрашивания свидетельствует о наличии крахмала.
Реакция Фелинга. К содержимому пробирки добавить примерно половину объема реактива Фелинга. Верхний слой жидкости нагреть на пламени спиртовки. Появление желтого окрашивания, переходящего в кирпично-красное, указывает на наличие редуцирующих углеводов.
Результат оформляют в виде таблицы, объясняют причины разной активности a-амилазы в зависимости от температуры.
| Nпроб | Температура °С | Реакция с реактивом Люголя | Проба Фелинга | выводы |
Влияние рН на активность амилазы
Оптимум - рН для различных ферментов имеет различное значение, это зависит от аминокислотного состава ферментов,
оpt рН для a-амилазы слюны – 6,8-7,0;
- липазы панкреатической – 7,0-8,5;
- пепсина 1,5 - 2,5;
- аргиназы – 9,5- 10,0;
- сахаразы кишечной- 5,8-6,2.
Любое изменение реакции среды (в кислую или щелочную сторону от оптимума – рН) снижает активность фермента. Последнее связано с изменением диссоциации ионогенных групп ферментного белка (в том числе и в активном центре). В результате меняется конформация всей молекулы фермента и форма активного центра. Таким образом, комплементарность между субстратом и активным центром фермента нарушается, образование фермент-субстратного комплекса замедляется и активность фермента снижается.
Изменение диссоциации ионогенных групп может происходить и в некоторых субстратах, что также приводит к нарушению комплементарности между активным центром и субстратом.
Смещение же рН в сильно кислую или щелочную сторону может вызывать денатурацию ферментного белка, потерю нативной конформации и разрушение активного центра фермента. Последнее исключает возможность образования фермент-субстратного комплекса и приводит к инактивации фермента.
Ход работы
1.В три пробирки вносят по 3 мл буферных растворов с рН 1,2; 6,8; 10.
2.Во все пробирки прибавляют по 2 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл разбавленной в 10 раз слюны. Содержимое пробирок перемешивают и помещают в термостат при 40°С на 10 минут.
3.Пробирки охлаждают, и с содержимым проделывают реакции Люголя и реакцию Фелинга. При этом следует учесть, что реакция на крахмал с раствором Люголя положительна только в кислой или нейтральной среде, а проба Фелинга протекает в щелочной среде.
4.Наблюдают результаты и данные вносят в таблицу.
| Nпроб | Рh среды | Реакция с реактивом Люголя | Проба Фелинга | Выводы |