Открытие ксантиноксидазы в молоке
Ксантиноксидаза (1.2.3.2.) относится к группе окислительно-восстановительных ферментов. Акцептором электронов служит кислород.
Ксантиноксидаза катализирует окисление гипоксантина в ксантин, а так же ксантина в мочевую кислоту:
| ОН | ОН | |
| ½ | ½ | |
| C | C | |
| // \ | // \ | |
| N C¾ N | О2 + Н2О | N C¾ N + Н2О2 |
 ½ || || | ½ || || | |
| Н¾С С С¾Н | НО ¾С С С¾Н | |
| \\ / \ / | \\ / \ / | |
| N N | N N | |
| ½ | ½ | |
| Н | Н |
гипоксантин ксантин
| ОН | ОН | |
| ½ | ½ | |
| C | C | |
| // \ | // \ | |
| N C¾ N | О2 + Н2О | N C¾ N + Н2О |
| ½ || || | ½ || || | |
| НО¾С С С¾Н | НО ¾С С С¾ОН | |
| \\ / \ / | \\ / \ / | |
| N N | N N | |
| ½ | ½ | |
| Н | Н |
ксантин мочевая кислота
Фермент способен окислять не только указанные пурины, но также птерины и ароматические и алифатические альдегиды. Так, например, формальдегид окисляется молекулярным кислородом при участии ксантиноксидазы с образованием муравьиной кислоты и перекиси водорода:
О О
// ксантиноксидаза //
Н¾С + Н2О + О2 Н ¾С + Н2О2
\ \
Н ОН
формальдегид муравьиная кислота
При определенных условиях ксантиноксидаза может передавать электроны и протоны не только кислороду воздуха, но и цитохромной системе. В условиях эксперимента ксантиноксидаза способна окислять субстрат за счет восстановления метиленовой сини и других красок, например, индиго, индофенола и др. Ксантиноксидаза содержится в молоке, печени, а так же в других тканях растительного и животного происхождения.
Оптимум действия ксантиноксидазы лежит в диапозоне рН от 5,5 до 8,5. Ксантиноксидаза является флавопротеидом, содержащим металл молибден (М0). Флавопроиды имеют в качестве простетической группы вещества, окрашенные в желтый цвет и построенные по типу флавинмононуклеотида (ФМН) или флафинадениндинуклеотида (ФАД).
При восстановлении ФМН и ФАД превращаются в дигидроформу. В отличии от оксидаз геминовой природы (цитохром-оксидазы), катализирующих окисление субстрата молекулярным кислородом с образованием молекулы воды, при действии на субстрат оксидаз флавиновой природы конечным продуктом является перекись водорода.
Разрушение перекиси водорода осуществляется при участии геминовых ферментов каталазы и пероксидазы. Если перекись водорода не удаляется из сферы реакции, то действие флавиновых оксидаз прекращается.
Принцип метода. Если к свежему молоку, содержащему фермент ксантиноксидазу, добавить формальдегид и метиленовую синь, и смесь изолировать от доступа кислорода, то спустя некоторое время синее окрашивание исчезнет.
Реакция обусловлена восстановлением метиленовой сини в лейкоформу за счет окисления формальдегида в муравьиную кислоту и проходит благодаря каталитическому действию фермента ксантиноксидазы.
Ход работы. В три пробирки наливают по 5 мл свежего коровьего молока. Одну пробу кипятят 2-3 минуты и охлаждают. В прокипяченную пробирку и в одну из некипяченных проб добавляют по 1 мл 0,4 % раствора формальдегида, а в другую некипяченную 1мл воды. Затем во все три пробирки приливают по 1 мл 0,1 % раствора метиленового синего. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и заливают 3-4 капли вазелинового масла для предохранения жидкости от соприкосновения с кислородом воздуха. Все пробы помещают в водяную баню, нагретую до 40 0С. Через некоторое время жидкость в некипяченной пробе, содержащей субстрат, обесцвечивается за счет образования восстановленной формы метиленового синего.
Если бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть, то раствор вновь приобретет синий цвет.
Вследствие отсутствия активного фермента в первой прокипяченной и субстрата в одной из некипяченных проб обесцвечивание метиленового синего в них не происходит.
Материала и реактивы: молоко свежее; 0,4 % раствор формальдегида; 0,02 н. раствор метиленовой синий; вазелиновое масло.
Оборудование : водяная баня; термостат; пробирки химические.