Определение активности АсАТ
1. Внесите в пробирку 0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения активности АсАТ и добавьте в пробирку 0,1 мл сыворотки крови.
2. Поместите пробирку в термостат на 15 минут, температура 37 С.
3. Затем добавьте в пробирку 0,5 мл раствора 2,4 –динитрофенилгидразина.
4. Реакционную смесь необходимо выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре,
5. Далее добавьте в пробирку 5 мл 0,4М раствора едкого натра и оставьте раствор на 10 минут при комнатной температуре для стабилизации окраски.
6. Через 10 минут необходимо измерить оптическую плотность раствора на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 500 – 560 нм) в кювете толщиной 1 см.
Определение активности АлАТ
1. Внесите в пробирку 0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения активности АлАТ и добавьте в пробирку 0,1 мл сыворотки крови.
2. Поместите пробирку в термостат на 30 минут, температура 37 С.
3. Затем добавьте в пробирку 0,5 мл раствора 2,4 –динитрофенилгидразина.
4. Реакционную смесь необходимо выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре,
5. Далее добавьте в пробирку 5 мл 0,4М раствора едкого натра и оставьте раствор на 10 минут при комнатной температуре для стабилизации окраски.
6. Через 10 минут необходимо измерить оптическую плотность раствора на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 500 – 560 нм) в кювете толщиной 1 см.
Для определения активности обоих ферментов Вам необходимо построить калибровочные графики. При построении калибровочного графика на оси ординат необходимо отложить значения оптической плотности, а на оси абсцисс - содержание пировиноградной кислоты (ПВК) в калибровочных пробах (в мкмолях). Активность ферментов в данных условиях исследования (в мкмолях ПВК, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки за 1 час), рассчитывается по формулам:
Х=10 х С (для АсАТ) и Х=10 х 2 х С (для АлАТ), где:
С- количество ПВК по калибровочному графику (в мкмолях);
10-коэффициент перерасчета на 1 мл сыворотки;
2- коэффициент перерасчета на 1 час инкубации.
Лабораторные нормы: для АсАТ - 0,1- 0,5 мкмолей ПВК на 1 мл сыворотки крови за 1 час инкубации, для АлАТ - 0,1-0,7 мкмолей ПВК на 1 мл сыворотки крови за 1 час инкубации.
Калибровочные графики зависимости оптической плотности растворов ПВК от содержания ПВК:
а) для определения активности АсАТ:
б) для определения активности АлАТ:
ВЫВОДЫ:
Подпись преподавателя:
Приложение 1
Граф логической структуры
ТЕМА 1.17. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ДЕТОКСИКАЦИИ АММИАКА И БИОСИНТЕЗА МОЧЕВИНЫ
Актуальность темы
Аммиак образуется главным образом при катаболизме аминокислот, биогенных аминов и нуклеотидов. Кроме того, большое количество аммиака образуется в кишечнике при гниении белков, а также в скелетных мышцах при усиленной физической нагрузке.
Аммиак является токсическим соединением, и для его обезвреживания в тканях и органах существуют специальные механизмы.
Наибольшую роль в процессе обезвреживания аммиака играет печень, в которой аммиак превращается в нетоксичную мочевину. Образование мочевины (орнитиновый цикл) имеет большое значение для сохранения здоровья. Однако при серьезных расстройствах в работе печени, например, при циррозе, тяжелом гепатите, отравлении ядами, жировом перерождении печени, а также при желудочно-кишечных кровотечениях, развитии коллатералей между системой воротной вены и общей системой кровообращения, аммиак накапливается в крови, приводя к гипераммониемии. Клинические проявления гипераммониемии усиливаются после приема белковой пищи, при этом количество мочевины в крови и моче снижается.
Лечение таких больных, а также детей, страдающих врожденной недостаточностью одного из ферментов цикла мочевины, должно быть основано на понимании процесса ее образования в печени.
Теперь ознакомьтесь с целями занятия.
Общая цель
Уметь оценивать состояние азотистого обмена и функциональное состояние печени и почек по результатам определения содержания мочевины в крови и моче для последующего использования в клинической диагностике.
Конкретные цели: Цели исходного уровня:
Уметь:
| 1. Интерпретировать воздействие аммиака на организм, его токсичность для ЦНС, симптомы | |
| 2. Интерпретировать пути обезвреживания аммиака в различных тканях, его транспорт по крови | Интерпретировать структуру и свойства аминокислот, амидов кислот (кафедра медицинской и фармацевтической химии) |
| 3. Обосновать роль и место синтеза моче-вины в обмене веществ как главного пути обезвреживания аммиака, его взаимосвязь с другими метаболическими путями | Интерпретировать структуру и свойства мочевины, методы ее определения в растворах (кафедра медицинской и фармацевтической химии) |
| 4. Интерпретировать данные о содержании мочевины в сыворотке крови и моче для оценки состояния азотистого обмена в норме и при патологии |
Для проверки исходного уровня Вам предлагается выполнить ряд заданий.
Задания для самопроверки и самокоррекции исходного уровня.
Задание 1. При гидролизе пептида образовались амфотерные соединения, образующие соли при добавлении как соляной кислоты, так и гидроксида натрия. Какие это соединения?
А. Оксикислоты
В. Жирные кислоты
С. Амиды кислот
D. a-аминокислоты
Е. Амины
Задание 2. К неизвестному веществу добавили раствор гидроксида натрия и нагрели. Наблюдалось посинение лакмусовой бумаги и резкий запах аммиака. Какое вещество было открыто этим опытом?
А. Аминокислота
В. Сложный эфир
С. Пептид
D. Амид кислоты
Е. Первичный амин
Задание 3. При нагревании мочевины с баритовой водой наблюдается выделение аммиака, посинение лакмусовой бумаги и образование белой мути карбоната бария. К какому классу соединений относится мочевина в соответствии с полученными данными?
А. К аминокислотам
В. К амидам кислот
С. К нитрилам
D. К первичным аминам
Е. К вторичным аминам
Задание 4. К кристаллам вещества добавили несколько капель азотной кислоты и нитрита натрия. При встряхивании выделяются пузырьки газа (азот и углекислый газ). Какое вещество разложилось при действии азотной кислоты?
А. Первичный амин
В. Вторичный амин
С. Мочевина
D. Аминокислота
Е. Мочевая кислота
Правильность решений заданий проверьте, сопоставив их с эталонами ответов.
Эталоны ответов к решению заданий для самопроверки и самоконтроля исходного уровня:
1 – D, 3 – В.
Информацию для восполнения исходного уровня можно найти в следующей литературе:
1. Тюкавкина Н. А., Бауков Ю. И. Биоорганическая химия. -М.: Медицина, 1991. – С. 182, 208-210, 314-318, 338 - 343
2. Рево А. Я., Зеленкова В.В. Руководство к лабораторным занятиям по биоорганической химии. - М.: Медицина, 1980. –С. 92-100
3. Лекции по биоорганической химии
Содержание обучения
Содержание обучения должно обеспечивать достижение целей обучения, чему способствует граф логической структуры изучаемой темы (Приложение 1).
Основные теоретические вопросы, позволяющие выполнить целевые виды деятельности:
1. Основные пути и источники образования аммиака в организме, причины и проявления
его токсичности
2. Важнейшие механизмы обезвреживания аммиака:
2.1. Восстановительное аминирование a-кетоглутарата
2.2. Образование амидов дикарбоновых кислот
2.3. Образование аммонийных солей в почках
2.4. Образование мочевины в печени
3. Роль аланина в транспорте азота аминокислот для синтеза мочевины
4. Орнитиновый цикл мочевинообразования. Механизм и ферменты процесса, его регуляция, взаимосвязь с ЦТК и трансаминированием
5. Особенности обезвреживания аммиака в нервной ткани
6. Принцип метода и ход работы по определению мочевины уреазным методом
Найти материал для освоения этих вопросов можно в одном из следующих источников:
Обязательная литература
1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ – Вінниця: НОВА КНИГА, 2007. – С. 295 - 300
2. Практикум з біохімії/ За ред. проф. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’ я, 2002. – С. 153 - 163
3. Тестовые задания по биологической химии/ Под ред.Б.Г.Борзенко. - Донецк, 2000.-С.148 – 202
4. Лекции по биохимии
5. Граф логической структуры (Приложение 1)
6. Инструкция к практическому занятию
Дополнительная литература
1. Губський Ю.Г. Біологічна хімія. - Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. - С. 242-247
2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998.-С. 446-451
3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М.: Медицина, 1990.-С. 350-354
4. Николаев А.Я. Биологическая химия. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 1998. - С. 315-323
5. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека.- М.: Мир, 1993. -
С. 309-316, 353
6. Ленинджер А. Основы биохимии. – М: Мир, 1985. –С. 585-598
После изучения вышеперечисленных вопросов для самопроверки усвоения материала по данной теме Вам предлагается решить следующие целевые обучающие задачи.
Целевые обучающие задачи
Задача 1. В клинику поступил пациент с повторяющимися рвотой, судорогами, припадками и потерей сознания, вызванными отравлением аммиаком. Что лежит в основе его токсического воздействия на нервную систему?
A. Ингибирование пентозофосфатного пути
B. Торможение анаэробного окисления глюкозы
C. Ингибирование ЦТК
D. Угнетение гликолиза
E. Торможение окисления свободных жирных кислот
Задача 2. У пациента, конечности которого длительное время были сдавлены, после удаления тяжести развились признаки печеночной комы, в крови выявлена гипераммониемия. Какой процесс привел к возрастанию содержания аммиака в крови пациента?
A. Восстановительное аминирование α-кетокислот
B. Синтез мочевины
C. Дезаминирование аминокислот
D. Декарбоксилирование аминокислот
Е. Распад билирубина
Задача 3. Аммиак - чрезвычайно токсичное вещество, особо опасное для мозга. Каким образом он переносится из периферических тканей в те органы, которые его обезвреживают или выводят из организма, но при этом мозг не подвергается опасности?
A. В свободном виде
B. В виде аммонийных солей
C. В виде мочевины
D. В виде креатина
E. В виде глутамина
Задача 4. В крови спортсмена после интенсивной нагрузки обнаружено возрастание содержания аланина и мочевины. В результате активации какого метаболического пути произошли эти сдвиги ?
A. Цикла трикарбоновых кислот
B. Глюкозо-аланинового цикла
C. Цикла Кори
D. Пентозофосфатного цикла
E. Синтеза глутамина
Задача 5. Спустя 36 часов после рождения у ребенка началась рвота, «всхлипывающее дыхание», развилось помутнение сознания, и исчезла реакция на внешние раздражители. Биохимический скрининг выявил очень высокие концентрации аммиака и аминокислот в плазме крови, а также снижение концентрации мочевины. Предположен диагноз – наследственное нарушение цикла мочевинообразования. Какой фермент может быть дефектным у данного ребенка?
A. Фосфорибозилпирофосфатамидотрансфераза
B. Аланинаминотрансфераза
C. Аденозиндезаминаза
D. Моноаминооксидаза
E. Карбамоилфосфатсинтетаза
Задача 6. В классических работах Г. Кребса с помощью метода меченых атомов установлено, что ЦТК и орнитиновый цикл мочевинообразования являются тесно связанными метаболическими процессами. Назовите общий метаболит обоих циклов.
А. Оксалоацетат
В. Цитруллин
С. Фумаровая кислота
D. Цитрат
Е. Орнитин
Правильность решений задач проверьте, сопоставив их с эталонами ответов.
Эталоны ответов к решению целевых обучающих задач:
1 – С, 3 - Е, 5 – Е.
Краткие методические рекомендации к проведению занятия
В начале занятия проводятся тестовый контроль исходного уровня знаний студентов и его коррекция, выполняют самостоятельную работу. Затем студенты приступают к выполнению лабораторной работы, используя при этом инструкцию.
После выполнения лабораторной работы необходимо оформить протокол, сделать выводы к работе, которые проверяет и контролирует преподаватель. Проводится анализ самостоятельной работы студентов и коррекция.
В конце занятия проходит итоговый контроль, подводятся итоги занятия.