Использование неорганического фосфата в процессе брожения

ФЕРМЕНТЫ

ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ

Методические указания к лабораторному практикуму

по дисциплине ”Биохимия"

для студентов специальностей Т.18.01., Т.18.02., Т.18.03.

Часть II. “Витамины и ферменты”

Могилев 2001

УДК 557.1

Рассмотрены и утверждены

на заседании кафедры ХТВМС

протокол № 10 от 18 мая 20001г.

Составители: доц. О.Н.Макасеева

асс. Л.М.Ткаченко

Рецензенты: проф. Г.Н. Роганов

доц. В.Н. Тимофеева

© Могилевский государственный технологический институт

Содержание

С

Введение.........................................................................................................4

1 НАД⁺- зависимые дегидрогеназы................................................................5

1.1 Использование неорганического фосфата в процессе брожения......6

1.2 Определение специфичности лактатдегидрогеназы............................8

2Флавиновые дегидрогеназы.........................................................................9

2.1 Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы....10

2.2Глюкозооксидаза (1.1.3.4)....................................................................12

2.3 Определение глюкозы с использованием фермента

глюкозоксиды..........................................................................................13

2.4 Открытие ксантиноксидазы в молоке.................................................14

3 Гемсодержащие ферменты - гемопротеины..........................................16 3.1Каталаза (1.11.1.6).................................................................................17

3.1.1 Обнаружение действие каталазы (качественно).............................17

3.1.2 Определение активности каталазы по А. Н. Баху и А.И.Опарину..............................................................................................18

3.2Пероксидаза (1.11.1.7)..........................................................................18

3.2.1 Обнаружение действия пероксидазы (качественно)......................19

Определение активности пероксидазы............................................20

4 Медь - содержащие оксидазы....................................................................21

4.1 Определение активности аскорбатоксидазы.....................................21

4.2 Полифенолоксидаза (1.14.18.1)...........................................................23

4.3 Обнаружение действия фенолоксидазы (качественно).....................24

4.4 Определение активности О–дифенолоксидазы

(полифенолоксидазы) и пероксидазы по Михлину и Броневицкой…..25

5 Список используемых источников...........................................................27

Приложение А...............................................................................................29

Приложение В............................................................................................30

Введение

К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие окислительно–восстановительные реакции. Общая схема их может быть представлена следующим образом:

оксидоредуктаза

Субстрат + Акцептор _{¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾>} Субстрат + Акцептор

АН₂ В ^{<¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾} А ВН₂

Характерной особенностью деятельности оксидоредуктаз в живой клетке является их способность образовывать системы ( так называемые цепи окислительно–восстановительных ферментов), в которых осуществляется многоступенчатый перенос атомов водорода или электронов от первичного субстрата к конечному акцептору, которым является, как правило, кислород, так что в результате образуется вода.

Другая особенность оксидоредуктаз состоит в том, что, будучи двухкомпонентными ферментами с весьма ограниченным набором активных групп (коферментов), они способны ускорять большое число самых разнообразных окислительно–восстановительных реакций. Это достигается за счет того, что один и тот же кофермент способен соединяться со многими апоферментами (белками), образуя каждый раз оксидоредуктазу, специфическую по отношению к тому или иному субстрату или акцептору.

Еще одна, пожалуй, главная особенность оксидоредуктаз заключается в том, что они ускоряют протекание химических процессов, связанных с высвобождением энергии. Последняя используется как для обеспечения синтетических процессов в организме, так и для других нужд.

Оксидоредуктазы, которые переносят атомы водорода или электроны непосредственно на кислородные атомы, носят название аэробных дегидрогеназ или оксидаз. В отличии от них оксидоредуктазы, переносящие атомы Н или электроны от одного компонента окислительной цепи ферментов к другому без передачи их на кислородные атомы, называют анаэробными дегидрогеназами или редуктазами.

Подклассы оксидоредуктаз определяются типами соединений, выступающих в качестве доноров электронов. Например, ферменты подкласса 1 катализируют окисление гидроксигрупп до карбонильных, подкласса 2 - окисление карбонильных до карбоксильных и т.д.

В отдельные подклассы выделены ферменты ( оксигеназы), катализирующие реакции введения атомов кислорода - одного, подкласс 14 (монооксигеназы) - двух, подкласс 13 (диоксигеназы) из молекулы О_2.

В данном методическом указании рассмотрены более подробно строение и механизм действия оксидоредуктаз, имеющих важное значение в процессах технологической переработки пищевого сырья и при его хранении. Не менее важна роль этих ферментов в процессах дыхания живых организмов, окисления органических соединений - углеводов, липидов, белков, снабжающих клетку энергией.

1 НАД⁺- зависимые дегидрогеназы

Ферменты, катализирующие реакции окисления-восстановления с участием никотинамидадениндинуклеотида (НАД⁺), или его близкого аналога - никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ⁺).

Более половины известных в настоящее время оксидоредуктаз содержат НАД⁺ или НАДФ⁺ в качестве кофермента, т.е являются двухкомпонентными, их называют пиридинпротеином. Пиридинпротеины способны отнимать от субстратов (спирты, альдегиды, кетокислоты, амины и др.) и включать в молекулу НАД⁺ (НАДФ⁺) 2 электрона и один протон ( гидрид ион Н^-) (окисляя, таким образом, указанные соединения, а второй протон остается в среде, в результате чего утрачивается положительный заряд пиридинового цикла НАД⁺ (НАДФ⁺):

Н		Н Н
½		\ /
С O		С O
// \ //		/ \ //
Н¾ С C ¾С- NH2		Н¾ С C ¾С- NH2
½ | |		| | | |
Н¾- С C- Н		Н¾- С C- Н
О \\ + /		О \ /
|| N		|| N
НО-Р- О-СН2 О		НО-Р- О-СН2 О
½ NН2 +2Н		½ NН2
½ Н Н ½		½ Н Н ½
О Н ½ ½ Н N C [ 2Н+,2е;	Н-, Н+]	О Н ½ ½ Н N C
½ НО НО // \ / \\		½ НО НО // \ / \\
НО-Р= О Н-C C N		НО-Р= О Н- C C N
½ ½ || ½		½ ½ || ½
О-¾ СН2 О N¾¾C CН		О -¾ СН2 О N¾¾C CН
½ \ //		½ \ //
½ Н Н N		½ Н Н N
Н ½ ½ Н Н3РО4		Н ½ ½ Н Н3РО4
НО О( Н)		НО О(Н)

НАД⁺ (НАДФ⁺ ) НАДН (НАДФН)

Все пиридинпротеины являются анаэробными дегидрогеназами, т.е не передают снятые с субстрата атомы водорода на кислород, а передают их на ближайший в окислительной цепи другой фермент, как правило, флавопротеид.

Кофермент НАДФ⁺ является производным НАД⁺, у которого водород ОН - группы 2-го углеродного атома рибозы аденозина замещен на остаток фосфорной кислоты. Механизм окисления (своих субстратов) при участии НАДФ⁺ в качестве кофермента аналогичен таковому при посредстве НАД⁺.

Несмотря на то, что реакции, катализируемые НАД⁺ и НАДФ⁺ зависимыми ферментами - дегидрогеназами обратимы, их биологическое значение в большинстве случаев связано, преимущественно, с протеканием реакции в определенном направлении. При этом отчетливо проявляется такая закономерность: если биологически значимо окисление субстрата, то в реакции в качестве окислителя чаще всего участвуют НАД⁺ . Если же реакция этого подкласса имеет значение для восстановления какого - либо органического соединения, то чаще всего восстановителем является НАДФН.

Использование неорганического фосфата в процессе брожения

Процессы диссимиляции углеводов в растительных организмах, микроорганизмах, а также в организмах животных и человека как в анаэробных, так и в аэробных условиях протекают с участием неорганического фосфата.

Молекула фосфорной кислоты включается на стадии окисления 3 –фосфоглицеринового альдегида в 1,3–дифосфоглицериновую кислоту при участии НАД⁺ зависимой глицеральдегидфосфатдегидрогеназы.

О				О
/ /				/ /
С¾ Н	+		глицеральдегид-	С¾О ~ (Р)	+
½	+ НАД	+ Н3РО4	¾¾¾¾¾¾¾>	½ +	НАДН+Н
Н¾С¾ОН			фосфатдегидро-	Н¾С¾ОН
½			геназа	½
СН2 ¾О(Р)				СН2 ¾О(Р)

3- фосфоглицериновый 1,3 - дифосфоглицериновая

альдегид кислота

1,3–дифосфоглицериновая кислота представляет собой высокоэнергетическое соединение (макроэргическая связь условно обозначена значком ~ “тильда”). Далее происходит передача богатого энергией фосфатного остатка на АДФ с образованием АТФ и 3 - фосфоглицериновой кислоты:

О				О
/ /			+2	/ /
С¾ О ~ (Р)			Мg	С ¾ ОН
½	+ АДФ		¾¾¾¾¾¾¾>	½ + АТФ
Н¾С¾ ОН ½ СН2 ¾О-(Р)			<¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾ фосфоглицераткиназа	Н¾С¾ОН ½ СН2¾О-(Р)

1,3 - дифосфоглицериновая 3 - фосфоглицериновая

кислота кислота

АТФ участвует в фосфорилировании углеводов - в образовании метаболически активных форм сахаров - их фосфорных эфиров, например, из глюкозы путем фосфорилирования образуется глюкозо–6–фосфат под действием фермента гексокиназы:

Мg²⁺

АТФ + L-D-глюкоза ¾¾¾¾¾> АДФ + L-D-глюкоза- 6 - фосфат

гексокиназа

Глюкозо–6–фосфат превращается во фруктозо–6–фосфат под действием фермента фосфоглюкоизомеразы. Далее фруктозо–6–фосфат фосфорилируется при участии еще одной молекулы АТФ и фермента фосфофруктокиназы во фруктозо–1,6–дифосфат.

Принцип метода. Если в начале брожения и в процессе взять одинаковые пробы и проделать качественную реакцию (молибденовую) на фосфорную кислоту, то окажется,что интенсивность образующейся синей окраски в пробах убывает от первой к последней. Это обусловлено тем, что неорганический фосфат постепенно поглощается и количество его в среде уменьшается.

Количество же связанного фосфата в органической форме (АТФ, глюкозо–6–фосфат, фруктозо–6–фосфат и др.) увеличивается. Если пробы подвергнуть гидролизу, то органические соединения фосфора разрушаются и количество неорганического фосфата во всех пробирках будет равно начальной величине – окраска в пробирках будет одинаковой.

Химизм молибденовой реакции на фосфорную кислоту заключается в образовании комплексного соединения 12 молибдофосфата аммония (осадок желтого цвета), которое при добавлении аскорбиновой кислоты восстанавливается с образованием молибденовой сини (смесь окислов молибдена).

Молибденовая реакция на фосфорную кислоту:

РО₄^–3+ 3 NH₄⁺+ 12 МоО₄^–2 + 24 Н⁺¾® (NH₄)₃РО₄ ^. 12 МоО₃ + 12 Н₂О

Ход работы. В четыре пронумерованные пробирки наливают по 1 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В ступке растирают 1 г отмытых и отделенных на воронке Бюхнера дрожжей с 1 г глюкозы или сахарозы и 5 мл дистиллированной воды. К смеси добавляют 5 мл раствора фосфорнокислых солей, перемешивают и 1 мл смеси переносят в первую пробирку с ТХУ. При этом осаждаются белки, инактивируются ферменты и прекращается брожение.

Оставшуюся смесь переносят в высокий стаканчик и помещают в термостат при 37 °С на 1,5 часа. Через каждые 0,5 часа от начала брожения отбирают из стаканчика по 1 мл бродящей смеси в три пробирки с ТХУ. Через 5 минут после взятия последней пробы содержимое пробирок фильтруют через складчатые фильтры в 4 пронумерованные колбочки и получают безбелковые фильтраты.

В четыре чистые пробирки отбирают по 0,5 мл безбелкового фильтрата из колбочек и проводят молибденовую реакцию на фосфорную кислоту. Для этого в каждую пробирку вносят по 0,1 мл 2,5 % – ного раствора молибденовокислого аммония в серной кислоте и 0,5 мл 0,5 %–ного раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и оставляют на 15 минут. Затем в каждую пробирку добавляют по 8 мл дистиллированной воды, перемешивают и сравнивают окраску жидкости во всех пробирках. Интенсивность окраски должна уменьшаться от первой к четвертой пробирке, так как неорганический фосфат в процессе брожения убывает.

Для гидролиза образовавшихся органических соединений фосфора в четыре пронумерованные пробирки (второй ряд) вносят из колбочек по 0,5 мл безбелкового фильтрата и добавляют по 0,5 мл 2 н. раствора соляной кислоты и ставят в кипящую водяную баню на 8–10 минут. По окончании гидролиза во всех пробирках проделывают молибденовую реакцию.

Результаты работы заносят в таблицу 1, изображая интенсивность окраски знаками +1; +2; +3; +4.

Таблица 1 – Интенсивность окраски молибденовой реакции

В процессе брожения

Показатели	№ пробирок и время взятия проб
	до брожения	через 30 минут	через 60 минут	через 90 минут
Реакция на ионы РО4-3 до гидролиза
Реакция на ионы РО4-3 после гидролиза органических соединений фосфора

Материалы и реактивы: дрожжи; 10 %–ный раствор трихлоруксусной кислоты; глюкоза или сахароза; фосфорнокислые соли, раствор (см. Приложение В,п.1); молибденовый аммоний, 2,5 % раствор в 10 % растворе серной кислоты; 0,5 %–ный раствор аскорбиновой кислоты; 2 н. раствор соляной кислоты.

Оборудование: фарфоровые ступки; пробирки; пипетки на 1 мл; колбы; термостат; водяная баня.