Методика приготовления реактивов

Фосфорнокислые соли, раствор. 6 г Na₂НРО₄ × 2Н₂О смешивают с 2 г КН₂РО₄ × Н₂О в 1 л воды.

Фосфатный буфер, рН 7,5. Готовят растворы А и Б. Приготовление раствора А: 1/15 М КН₂РО₄ (9,078 г/л). Приготовление раствора Б: Nа₂НРО₄ 2 Н₂О (11,876 г/л). Для приготовления фосфатного буфера рН 7,5 смешивают 130 мл раствора А и 870 мл раствора Б.

Экстракт мышечной ткани. 300 мг мышечной ткани экстрагируют в фарфоровой ступке с 20 - кратным объемом дистиллированной воды. Смеси фильтруют через марлю и экстракцию повторяют еще 2 раза. Отмытая от редуцирующих веществ мышечная кашица содержит сукцинатдегидрогеназу, и некоторые другие ферменты ( цитохром, цитохромоксидазу прочно связанные с клеточной структурой.

Фосфатный буфер, рН 7,4. Готовят растворы А и Б. Приготовление раствора А: 1/15 М КН₂РО₄ (9,078 г/л). Приготовление раствора Б: Nа₂НРО₄ 2 Н₂О (11,876 г/л). Для приготовления фосфатного буфера рН 7,4 смешивают 192 мл раствора А и 808 мл раствора Б.

Раствор фермента. 250 мкг глюкозооксидазы из плесневого гриба и 41,7 мкг пероксидазы из корней хрена растворяют в 10 мл 0,1 М Nа-фосфатного буфера, рН 7,0.

Раствор 3. Один объем раствора 2 осторожно прибавляют по капле при интенсивном перемешивании к 100 объемам раствора 1.

Кровь дифибринированная или вытяжка из моркови (картофеля). Морковь натирают на терке, берут 4 г, растирают с битым стеклом в ступке, добавляя 4-6 мл 0,05 % - ного раствора углекислого натрия. Растертую массу переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки раствором Nа₂СО₃. Смесь настаивают 30 - 60 мин. и фильтруют.

Вытяжка из муки или другого растительного материала. На аналитических весах отвешивают по разности в мерную колбу (вместимостью 50 мл) 2 г муки или хорошо измельченного растительного продукта. В колбу приливают дистиллированную воду, содержимое ее хорошо перемешивают, добавляют 2-3 капли толуола, доводят водой до метки и смесь настаивают 2 ч при комнатной температуре. Затем жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр или центрифугируют. В фильтрате или центрифугате тот час же определяют каталазу.

Экстракт из хрена или вытяжка из мяса; 100 г свежих корней хрена натирают на терке, заливают 100 мл 0,05 % - ного раствора Nа₂СО₃ и через 2 -3 часа фильтруют. Вытяжка из мяса. 10 г фарша свежего мяса заливают 40 мл дистиллированной воды, настаивают 10 мин. и фильтруют.

Ферментный раствор. 100 г свежих корней хрена натирают на терке, заливают 100 мл 0,05 % - ного раствора Nа₂СО₃ и через 2 -3 часа фильтруют. Фильтрат является источником пероксидазы.

Фосфатный буфер с рН 7,3 - 7,4. Готовят растворы А и Б. Приготовление раствора А: 1/15 М КН₂РО₄ (9,078 г/л). Приготовление раствора Б: Nа₂НРО₄ 2 Н₂О (11,876 г/л). Для приготовления фосфатного буфера рН 7,3 - 7,4 смешивают 192 мл раствора А и 808 мл раствора Б.

Ацетатный буфер, 0,3 М раствор, рН 4,7. Состоит из двух растворов в соотношении 1:1: 0,3 М раствор уксусной кислоты и 0,3 М раствор уксуснокислого натрия.

Крахмал, индикаторный раствор. 1 г. растворимого крахмала размешивают с 10 мл холодной воды и постепенно вливают в 90 мл кипящего насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения и охлаждают.

ФЕРМЕНТЫ ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ

Часть II “Витамины и ферменты”

Методические указания

к лабораторному практикуму

по дисциплине "Биохимия"

для студентов специальностей

Т.18.01., Т.18.02., Т.18.03

Составители: доц. Макасеева Ольга Николаевна

асс. Ткаченко Лариса Михайловна

Рецензенты: проф. Роганов Геннадий Николаевич

доц. Тимофеева

Редактор и