Выявление бактерий из рода кишечной палочки

Сущность выявления бактерий из рода кишечной палочки — Эшерихий заключается в определении морфологии, характера роста на элективных средах с лактозой и отсутствия способности образовывать цитохромоксидазу, утилизировать цитрат, образовывать сероводород и способности продуцировать индол.

Проведение исследования. Наличие роста на чашках с элективными средами (Эндо, Левина, Плоскирева) окрашенных колоний, вследствие ферментации ими лактозы и изменения цвета индикатора — лактозоположительных вариантов кишечной палочки (или не изменяющих цвета среды колоний лактозоотрицательных) требует их определения для установления присутствия их в мясе или паренхиматозных органах и дифференциации по биохимическим свойствам от других сходных бактерий из семейства кишечных.

На агаре Эндо бактерии кишечной палочки-Эшерихии растут в виде красных с металлическим блеском (или без блеска) розовых с красным центром или белых колоний; на эозин-метиленовом синем агаре (агаре Левина) — в виде темно-фиолетовых блестящих колоний; на бактоагаре Плоскирева — в виде кирпично-красных с глянцевой поверхностью колоний.

Из колоний, характерных для бактерий кишечной палочки-Эшерихии, готовят мазки, окрашивают по Грамму и микроскопируют.

Бактерии кишечной палочки-Эшерихии — мелкие палочки с закругленными концами по Грамму окрашиваются отрицательно.

Для определения подвижности культуры готовят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют.

Бактерии кишечной палочки-Эшерихии чаще подвижны.

При наличии колоний, характерных для бактерий кишечной палочки-Эшерихии, их дифференцируют от других сходных микроорганизмов по биохимическим свойствам, указанным в табл. 1.

Биохимические свойства бактерий Таблица 1

Биохимические дифференцирующие свойства	Род микроба
Биохимические варианты Eschericha	Proteus
1	2	3	4	5	6	Pr. vulgaris	Pr. mirabilis
Образование сероводорода на трехсахарном агаре с двойной сернокислой солью закиси железа и аммония (солью Мора)	-	-	-	-	-	-	+	+
Образование газа на глюкозе на трехсахарном агаре с двойной сернокислой солью закиси железа и аммония (солью Мора)	+	-	+	-	+	-	+	+
Ферментация 10%- ной лактозы	+	+	+	+	-	-	-	-
Образование индола	+	+	-	-	+	+	+	-
Расщепление мочевины	-	-	-	-	-	-	+	+
Утилизация цитрат (на Симмонса)	-	-	-	-	-	-	Различно	Различно
Подвижность	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	+	+
Ферментация мальтозы	+	+	+	+	+	+	+	+
Ферментация маннита	+	+	+	+	+	+	-	-

Условные обозначения:

«+» — положительный результат;

«—» — отрицательный результат;

«+/—» — положительный или отрицательный результат

Для определения сероводорода испытуемую культуру засевают на трехсахарный агар, уколом столбик, и помещают в термостат на 24ч при температуре37°С.

Бактерии кишечной палочки - Эшерихии не образуют сероводорода, и столбик агара почернения не дает.

Для установления способности бактерий кишечной палочки-Эшерихии расщеплять мочевину, испытуемую культуру засевают на трехсахарный агар с мочевиной и выдерживают 24ч в термостате при температуре 37°С.

Бактерии кишечной палочки-Эшерихии не расщепляют мочевину и не изменяют цвет среды. При наличии бактерий, расщепляющих мочевину, реакция среды становится резкощелочной, и среда окрашивается в ярко-красный цвет.

Ферментацию лактозы устанавливают посевом испытуемой культуры кишечной палочки-Эшерихии в среду Гисса, содержащую 10 % лактозы, большинство бактерий кишечной палочки ферментируют лактозу.

Индол определяют при помощи индикаторной бумажки пропитанной раствором 5,0 г парадиметиламидобензальдегида + 10 кубиков очищенной концентрированной фосфорной кислоты, растворяют в 50 кубиках 96 градусного спирта. В тепловатом растворе смачивают фильтровальную бумагу высушивают и нарезают, цвет бумаги желтый, при наличии индола цвет меняется от сиреневато-розового до интенсивно-малинового. Бактерии кишечной палочки - Эшерихии чаще образуют индол и окрашивают индикаторную бумажку в красный цвет.

Для определения способности утилизировать цитраты испытуемую культуру засевают на скошенный агар Симмонса, посевы помещают в термостат на 24 ч при температуре 37°С. Бактерии кишечной палочки-Эшерихии не растут на этой среде и не меняют ее цвета, бактерии, ассимилирующие цитрат, растут, подщелачивая среду и изменяя ее цвет из оливково- зеленого в синий.

Обработка результатов. Обнаружение отрицательных по Грамму палочек, образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, ферментирующих 10%-ную лактозу, образующих индол, не расщепляющих мочевину, не ассимилирующих цитраты, не образующих сероводород, указывает на наличие бактерий кишечной палочки-Эшерихий.

4.2.4. Выявление бактерий из рода протея

Сущность метода выявления бактерий из рода протея заключается в определении морфологии, определении роста на питательных средах и способности гидролизовать мочевину, образовании сероводорода и отсутствии ферментации маннита.

Наличие на средах в чашках вуалеобразного налета (Н-форма), при микроскопии которого обнаруживают полиморфные подвижные палочки, окрашивающиеся по Грамму отрицательно, указывает на присутствие вульгарного протея; наряду с колониями, которые дают расплывающийся по поверхности рост, могут встречаться изолированные колонии средней величины, нежные полупрозрачные с розоватым центром, палочки из этих колоний лишены жгутиков и неподвижны (0-форма).

Для подтверждения наличия протея (Н-форма) производят посев в конденсационную воду скошенного агара (способ Шукевича).

Для обнаружения «нероящихся» О-форм производят посев на агар Плоскирева.

О-форма протея растет на этой среде в виде прозрачных колоний, обладающих характерным запахом и слегка подщелачивающих среду, которая окрашивается около них в желтый цвет. Более старые колонии нередко мутнеют, а их центр принимает бурую окраску.

Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, образующих характерный рост на средах Н-форма, подвижных (О-форма — неподвижные), ферментирующих глюкозу и мочевину, не ферментирующих лактозу и маннит, укатывает на наличие бактерий из рода протея.

4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ.

Сущность метода выявления анаэробных бактерий заключается в определении их способности расти в отсутствии кислорода воздуха, морфологии возбудителей, роста на питательных средах и на выявлении патогенности возбудителей путем заражения лабораторных животных.

Удовлетворительные анаэробные условия создаются в жидкой питательной среде, где в качестве восстановителя применяют мясо, печень, которые одновременно служат и источником питания.

Среда должна быть фасована во флаконы или пробирки таким образом, чтобы площадь поверхности среды по абсолютной величине не превышала 1/10 её объема, и поверхность ее была изолирована от кислорода воздуха.

Исследование на анаэробные бактерии проводят при подозрении на следующие заболевания: эмфизематозный карбункул, злокачественный раневой газовый отек, брадзот овец, дизентерию ягнят, энтеротоксемию овец, столбняк, некробактериоз, ботулизм.

Про ведение исследования. Материалом для исследования при эмфизематозном карбункуле, и злокачественном раневом газовом отеке являются: кусочки пораженных мышц, отечные ткани, лимфашческие узлы, печень и селезенка; при брадзоте овец — кровь из сердца, слизистая оболочка сычуга и тонкого отдела кишечника, инфильтрат подкожной клетчатки; при дизентерии ягнят и энтеротокссмии овец — содержимое кишечника, пораженная почка; при столбняке — раневой секрет, гной, кусочки тканей, которые берут из глубоких слоев пораженных участков; при некробактериозе — некротические фокусы паренхиматозных органов, при ботулизме — содержимое желудка, толстых кишок, селезенка, кусок печени и головной мозг.

Диагноз на анаэробные инфекции ставят на основании бактериоскопии, посева материала и биопробы на животных.

Для бактериоскопии из материала готовят несколько мазков или мазков-отпечатков, которые окрашивают метиленовой синью или по Грамму. При просмотре мазков обращают внимание на форму, распопожение отдельных микробов, наличие и расположение спор, наличие капсул и отношение к окраске по Грамму.

Для посева материал обжигают и навеску массой 10г растирают в стерильной ступке с добавлением двойного количества физиологического раствора.

По 3—5см3 приготовленной взвеси засевают в четыре большие пробирки с мясной средой типа Тароцци, залитой слоем вазелинового масла толщиной 0,5см, предварительно прогретой в кипящей водяной бане в течение 20—30мин, а затем быстро охлажденной до температуры не ниже 50°С.

Посевы перед термостатированном прогревают для всех указанных анаэробов две пробирки при температуре 80°С в течение 20мин; при исследовании на Cl. botulinum типа Е одну пробирку при температуре 60°С в течение 15мин (при этом сохраняются споры Cl. botulinum типа Е), а другую при 80°С в течение 20мин. Остальные пробирки оставляют непрогретыми.

При подозрении на Cl. botulinum для выявления типа Е две пробирки — одну непрогретую и одну прогретую при 60°С выдерживают при температуре 28°С. Другие две пробирки (непрогретую и прогретую при 80°С) инкубируют при температуре 37 °С на другие анаэробные бактерии.

Термостатирование проводят в течение 5—10 суток, наблюдение за ростом производят ежедневно.

При обнаружении роста производят микроскопическое исследование.

В случае необходимости изучают культурные и биохимические свойства выделенной чистой культуры

Для биологической пробы используют исходный материал, а также культуру.

Заражение опытных животных производят тем же материалом, который используют для бактериологических посевов.

При подозрении на эмфизематозный карбункул заражают внутримышечно морскую свинку взвесью в дозе 0,5—1см3, которая погибает через 16—96 ч, при подозрении на злокачественный отек также заражают внутримышечно морскую свинку или мышь взвесью в дозе 1см3, которая погибает через 12—24ч после инъекции, при подозрении на брадзот овец заражают подкожно или внутримышечно морскую свинку которая погибает через 1—2 суток, при подозрении на дизентерию ягнят и энтеротоксемию овец для внутримышечного заражения используют кроликов или морских свинок, которые погибают в течение первых суток, при подозрении на столбняк заражают фильтратом из культуры в дозе 0,5—0,8см3 подкожно белых мышеи в области корня хвоста, животные погибают на 3—4 сутки, при подозрении на некробактериоз заражение в дозе 0,5—1см3 кроликов и белых мышей производят под кожу в области уха (кролик) или живота (мышь). На месте инъекции, особенно на ухе, появляются некрозы. Животные погибают через 5—10 суток иногда они выживаемость.

Исследование на определение ботулизма (токсинообразование) проводят на белых мышах.

5. УИРС- оформить сопроводительный документ-направление в ветеринарную лабораторию.

По результатам исследований дать санитарную оценку мяса.

Приложение №1

Направление в ветеринарную лабораторию

________________________________________

«_____» _____________ 200 г.

1. Хозяйство, направившее отобранные образцы проб в лабораторию______________________________________________________

2. Гл. вет. врач хозяйства ___________________________________________

3. Кто отбирал, упаковывал и направил в ветлабораторию пробы__________

4. Дата и время взятия проб__________________________________________

5. Материал подлежащий исследованию_______________________________

__________________________________________________________________

6. Краткое описание, причины бак. исследования______________________________________________________

7. Предполагаемый диагноз___________________________________________

8. Провести исследование на _________________________________________

_________

Подпись_______________

Приложение №2

БЛАНК-АНАЛИЗ №2

бактериологического исследования мяса.

№№ анализов и дата начала исследования
Кем и когда направлен материал и адрес владельца
Наименование материала и упаковка
Анамнестические данные
Патанатомические и органолептические данные
Результат бактериоскопии мяса
Характеристика колоний на МПА и микроскопия
Внешний вид колоний на агаре Эндо и учет бактериальной загрязненности
Наличие роста на среде обогащения
Результат микроскопии колоний с агара Эндо и исследования на подвижность
Результат пробной агглютинации
Характер роста на МПА, МПБ, желатине.
Подвижность
Изменение сред пестрого ряда: Лактоза_____________________ Сахароза____________________ Глюкоза_____________________ Манит______________________ Арабиноза___________________ Дульцит_____________________ Ксилоза_____________________ Бульон с глицерином (Штерна)_ Рамноза по Битеру___________
Реакция на индол Сероводород
Результат пробирочной или монореципторной агглютинации
Рост на каре по Щукевичу и микроскопия
Реакция преципитации на сиб. язву. Дата.
Биопроба
Вид выделенных бактерий, откуда.
Заключение об использовании мяса.
Дата дачи заключения.

Исследование произвел__________

Работу принял__________________

Оценка работы__________________

Лабораторная работа №15

Тема: "Ветеринарно-санитарная экспертиза молока"

Цель занятия: научить студентов отбору проб молока, проведению органолептических и лабораторных исследований с последующим заполнением качественного удостоверения.

Время: 180минут.

Место проведения: учебная лаборатория кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животноводства и гигиены с.-х. животных

Оборудование и реактивы: пробы молока, мутовки, пробоотборники, прибор "Лактан", прибор "Соматос", аппарат "Рекорд", фильтры, весы технические, разновесы, водяные бани, колбы, мерные стаканы, пробирки, таблицы, реактивы.

Рекомендуемая литература

1.ГОСТ Р52054-2003 "Молоко натуральное коровье - сырье"

2.ГОСТы "Молоко и молочные продукты Технические условия", 2001

3.ГОСТы "Молоко и молочные продукты Общие методы анализа", 2001

4. "Правила ветеринарно-санитарной экспертизы молока и молочных продуктов на рынках", 1976

5. СанПиН 2.3.4.551-96 "Производство молока и молочных продуктов"

6. Зобкова 3. С. Пороки молока и молочных продуктов и меры их предупреждения —М.: Молочная промышленность 1998 -76с

7. Степанова Л. И. Справочник технолога молочного производства. Технология и рецептуры Т 1 , 1999

8 Позняковский всэ мол.

9. СанПиН 2.3.2.078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.

План:

Введение

1. Показания для исследования молока и отбор средних проб

2 ГОСТ Р52054-2003 "Молоко натуральное коровье - сырье".

3. Схема полного лабораторного исследования молока

4. Методы исследования

4.1. Определение плотности молока

4.2. Определение кислотности молока

-титрометрический метод,

- проба кипячением

4.3. Определение чистоты молока

4.4. Определение бактериальной обсемененности молока.

4.5. Контроль за пастеризацией молока

-пероксидазная проба,

-фосфотазная проба

-лактоальбуминовая проба

4.6. Контроль натуральности молока

-определение добавления воды,

-определение подснятия жира,

-определение двойной фальсификации

4.7. Определение посторонних примесей в молоке:

-крахмала,

- формалина,

-перекиси водорода,

-соды,

-крови и гноя кетоновых тел,

-антибиотиков.

4.8. Исследование молока на обнаружение коров больных маститом

-проба с мастидином

- проба с димастином

4.9. Исследование молока на бруцеллез

5.УИРС. Ветеринарно-санитарная оценка исследуемых проб молока с заполнением качественного удостоверения.

6.Контрольные вопросы.

7.Приложение

Введение

Молоко — биологическая жидкость, выделяемая молочной железой млекопитающих и предназначенная для поддержания жизни и роста новорожденного Молоко синтезируется клетками эпителиальной ткани молочной железы из питательных веществ, поступающих в молочную железу с кровью Сложный химический состав, взаимосвязь отдельных компонентов обусловливают специфические свойства, высокую пищевую и биологическую ценность характерные только для молока.

Молоко - продукт скоропортящийся, так как служит благоприятной средой для развития микрофлоры, в том числе и патогенной. Нарушение режима содержания и кормления молочных животных, невыполнение санитарно-гигиенических требований при получении, первичной обработке, хранении и транспортировке молока могут существенно повлиять на технологические и пищевые его качества и порой даже сделать не только непригодным, но и вредным для человека и животных.