Сорбенти, що використовуються в молекулярно-ситовій хроматографії
| Тип сорбенту | Молекулярна маса речовин, що розділяються, Дальтон | Тип сорбенту | Молекулярна маса речовин, що розділяються, Дальтон |
| Декстран Сефадекс G-10 Сефадекс G-25 Сефадекс G-50 Сефадекс G-100 Сефадекс G-200 | <700 1000–5000 1500–3000 4000–150000 5000–800000 | Поліакриламід Біогель Р2 Біогель Р6 Біогель Р150 Біогель Р300 | 200–2000 1000–6000 15000– 150000 60000–400000 |
| Агароза Сефароза 6В Сефароза 4В Сефароза 2В Біогель А-0,5М Біогель А-15М Біогель А-150М | 1∙106–4∙106 5∙106–20∙106 20∙106–40∙106 3000–50000 40000–15∙106 5∙106–150∙106 | Ультрогелі акриламідагарози Сефакрил S-200 S-300 S-400 S-500 S-1000 | 1000–15000 10000–130000 10000–1200000 1000–80000 1000–750000 10000–2∙106 40000–20∙106 500000–100∙106 |
Декстринові гелі застосовуються в основному для фракціонування сферичних біомолекул.
Гелі на основі агарози являють собою лінійні полімери, елементарною ланкою яких є D-галактозо-3,6-ангідридо-L-галактоза. Агароза дає механічно стійкий гель за рахунок водневих зв’язків без поперечних зшивок. Агароза розчиняється в киплячій воді, а при охолодженні утворюється гель. В умовах процесу гель-фільтрації агароза стабільна, але руйнується при дії кислот, лугів, окисників.
Для надання жорсткості та хімічної стійкості, особливо в лужних середовищах, сефарозу іноді «зшивають» 2,3-дібромпропанолом. Така сефароза може діяти в діапазоні рН від 3 до 14 і витримувати нагрівання до 1200С.
Для гель-фільтрації використовуються також біогелі серії А на агарозній матриці.
Сефакрил являє собою зернистий гель, який отримують зшиванням алілдекстрину N,N'-метиленбісакриламідом. Сефакрилові гелі характеризуються гідрофільністю, хімічною інертністю, працюють при рН від 2 до 11.
Поліакриламідні гелі отримують кополімеризацією акриламіду та N,N'- метиленбісакриламіду. Пористість та жорсткість гелю визначається відсотковим вмістом у ньому полімеру, а розмір пор – ступенем зшивання компонентів.
У порівнянні з декстриновими та агарозними поліакриламідні гелі відрізняються тим, що можна отримувати більш широкий спектр розмірів пор.
В молекулярно-ситовій хроматографії межі молекулярних мас, в яких відбувається фракціонування речовин, в першу чергу визначаються розмірами пор гелю. Але і розміри зерен полімеру теж мають значення. Із збільшенням розмірів гранул прискорюється потік елюенту і погіршується розділення. Тому для аналітичних цілей слід застосовувати дуже малі гранули сорбенту. Крупніші гранули застосовуються для розділення значних кількостей речовин, коли ступінь розділення не має більшого значення, ніж швидкість розділення.
Для гель-фільтрації, коли треба застосувати високий тиск, використовуються готові фірмові колонки із застосуванням крупнопористих силікагелів у вигляді сферичних гранул діаметром 5 і 10мкм, покритих спеціальними речовинами для пригнічення сорбції на поверхні силікагелю.
Колонки для хроматографування при низькому тиску готуються в лабораторних умовах. Вибір довжини та діаметра колонки визначається об’ємом розчину суміші речовин, що розділяються, і конкретними задачами. Від цього залежить співвідношення висоти і діаметра колонки. Наприклад, якщо метою є знесолення суміші високомолекулярних речовин, відношення висоти до діаметра колонки може становити 10:1, для фракціонування речовин це відношення може становити 100:1. Для фракціонування застосовуються довгі колонки до 3-4 метрів і більше.
Більшість сорбентів, за винятком сефадексів та біогелів типу Р, постачаються у вигляді водних суспензій, які перед внесенням у колонку спочатку фракціонують до вужчого діапазона розмірів, а потім розводять до потрібної консистенції. Колонки треба заповнювати сорбентом якомога однорідніше. Від цього залежить якість розділення речовин. Однорідність заповнення колонки сорбентом перевіряють, пропускаючи крізь колонку розчин забарвленої високомолекулярної речовини.
Замість циліндричної колонки можна застосувати тонкошаровий варіант молекулярно-ситової хроматографії. На скляну пластинку наноситься тонкий шар (0,4-1мм) пористого гелю. При цьому елюювання здійснюється за рахунок руху рідини вздовж пластинки з однаковою швидкістю по всій її ширині. Загальна швидкість елюювання регулюється зміною нахилу пластинки під кутом від 5 до 200. На кінці пластинки рівномірно розташовуються гноти з фільтрувального паперу, які занурюються з другого краю в резервуари з елюентом. Суміш речовин, що розділяються, наноситься на стартову лінію у верхній частині пластинки.
Гель-фільтрація в тонкому шарі має високу чутливість та швидкість розділення, для цього достатньо використання малих кількостей речовин, що аналізуються, можливе одночасне дослідження багатьох препаратів. Іноді тонкошарова гель-фільтрація може доповнити або навіть замінити електрофорез та електрофокусування.
Цей метод застосовується для розділення, визначення молекулярних мас та перевірки чистоти високомолекулярних гідрофільних сполук.
§ 90. Запитання для самоперевірки та контрольні запитання
з хроматографічних методів аналізу
1. Навести класифікацію хроматографічних методів аналізу.
2. Які переваги хроматографічних методів розділення речовин над іншими?
3. У чому сутність адсорбційної хроматографії?
4. Які є типи ізотерм адсорбції?
5. За яких умов можна розділити молекули речовин на основі адсорбції їх на поверхні адсорбенту?
6. Які речовини використовуються як адсорбенти в адсорбційній хроматографії?
7. Які речовини доцільно розділяти на полярних адсорбентах, а які на неполярних і чому?
8. Які розчинники доцільно застосовувати для розділення полярних речовин?
9. Які вимоги пред’являються до вибору розчинника в адсорбційній хроматографії?
10. У чому сутність колоночної адсорбційної хроматографії?
11. У чому сутність тонкошарової адсорбційної хроматографії?
12. На якому законі базується розподільна хроматографія. В чому суть цього закону?
13. Які існують види розподільної хроматографії?
14. Які носії для закріплення однієї з фаз використовують у розподільній хроматографії?
15. Що таке «проявлення хроматограми»?
16. У чому сутність розподільної хроматографії на папері?
17. Який принцип повинен виконуватись при виборі системи рідких фаз для розподільної хроматографії?
18. Що таке «величина Rf» і який її фізичний зміст?
19. Чому величина Rf хоча і є табличною, але малопридатна для ідентифікації речовин на хроматограмах?
20. Яким прийомом доцільно користуватися для ідентифікації речовин на хроматограмах розподільної хроматографії?
21. Які існують різновиди паперової розподільної хроматографії за технікою виконання? Які переваги і недоліки цих різновидів?
22. Що таке метод проточної паперової розподільної хроматографії і коли він застосовується?
23. У чому сутність одномірної і двомірної розподільної хроматографії?
24. Які є методи виявлення речовин на хроматограмах? У яких випадках застосовується той, чи інший метод?
25. Які виявляються недоліки одномірної хроматографії, у чому їх сутність і які прийоми застосовують для усунення цих недоліків?
26. Що є спільне між розподільною і газовою хроматографіями?
27. Які є різновиди газової хроматографії?
28. У чому сутність газорідинної хроматографії?
29. Які основні вимоги пред’являється до рідких речовин при їх розділенні методом газорідинної хроматографії?
30. Які речовини використовуються як носії нерухомої фази у газорідинній хроматографії і які вимоги пред’являються до них?
31. Які речовини використовуються як носії рухомої фази у газорідинній хроматографії?
32. Який показник є характерною величиною для кожної речовини і даної рідкої фази у газорідинній хроматографії?
33. Які типи детекторів застосовуються для виявлення речовин, що розподіляються у методі газорідинної хроматографії? У чому сутність цих детекторів?
34. Які області застосування газорідинної хроматографії?
35. У чому сутність йоннообмінної хроматографії?
36. Дайте характеристику суті катіонітів і аніонітів.
37. У яких формах застосовуються в йоннообмінній хроматографії катіоніти? Яка з цих форм більш прийнятна?
38. Яка будова і принципи дії йоннообмінної колонки?
39. Що таке обмінна ємність іоніту?
40. Якими критеріями іоніту слід користуватися при його виборі для розділення конкретних сполук?
41. Вкажіть області застосування йоннообмінної хроматографії в аналітичній практиці?