Лабораторная работа 1. Биуретовая реакция

А.В. Анкудинова, В.Г. Шмелева,

Е.И. Помешалкин

Лабораторный практикум

По химии белка

Методические указания

Санкт-Петербург

УДК 577.112

Анкудинова А.В. Лабораторный практикум по химии белка [текст]: методические указания / А.В. Анкудинова, В.Г. Шмелева, Е.И. Помешалкин. – СПб.: СПбГТИ(ТУ), 2010. – 42 с.

В методических указаниях представлены основные лабораторные работы необходимые для практического изучения биохимических процессов в клетке.

Методические указания предназначены для студентов 3 курса факультета тонкого органического и микробиологического синтеза и соответствуют рабочей программе по дисциплине «Биологическая химия».

Табл. 6. Ил. 1. Библиогр. 4 назв.

Рецензент:

Д.О. Виноходов, д-р биол. наук, профессор кафедры молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ)

Утверждены на заседании учебно-методической комиссии факультета тонкого органического и микробиологического синтеза 21.09 .2010

Рекомендованы к изданию РИСо СПбГТИ (ТУ)

ВВЕДЕНИЕ

Биологическая химия является одной из наиболее важ­ных теоретических дисциплин в системе биологического об­разования инженеров-технологов микробиологических про­изводств.

Настоящие методические указания включают цикл лабо­раторных работ по разделу «Химия белка». Описанию каж­дой работы предшествует краткий теоретический материал с описанием механизмов протекания реакций. В конце даны контрольные вопросы, которые могут использоваться сту­дентами для подготовки к контрольным работам, а также для самостоятельной работы.

ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА БЕЛКА

Среди органических соединений, встречающихся в клет­ке, первое место занимают белки – на их долю приходится не менее 50% сухого веса клетки. По химической природе белки представляют собой высокомолекулярные соединения, построенные из сотен или тысяч аминокислотных остатков. В белковых молекулах аминокислоты располагаются таким образом, что карбоксильная группа одной аминокислоты свя­зана с α-аминогруппой другой пептидной связью.

У аминокислот, имеющих две аминогруппы (лизин, арги­нин) или две карбоксильные группы (аспарагиновая, глютаминовая), в реакцию образования пептидов вступают толь­ко те карбоксильные и аминогруппы, которые стоят у α-углеродного атома.

Молекула белка состоит из одной или нескольких поли­пептидных цепей, соединенных между собой главным обра­зом водородными связями. Кроме водородных связей в моле­куле белка между полипептидными цепочками возникают и другие связи (например, эфирные, дисульфидные и др.), об­разованные за счет фенольных (тирозин), спиртовых (серин), сульфгидрильных (цистеин) и других групп, имеющихся в полипептидных цепочках.

Каждый тип белка обладает особым, свойственным только ему химическим составом, определенным молекулярным весом и специфической последовательностью аминокислотных остатков. Это и определяет разнообразие существующих в природе белков (табл. 1).

Присутствие белка в биологических объектах или рас­творах можно обнаружить с помощью цветных реакций, ко­торые обусловлены наличием аминокислот в белке, их спе­цифическими группами или пептидными связями.

Ряд химических веществ дает окраску продуктов реакции при взаимодействии с белками. Эти реакции применяются для качественного и количественного определения белка и присутствующих в нем аминокислот.

Таблица 1 – Аминокислоты, встречающиеся в белках

Аминокислота	Формула	Сокра- щенное обозначение
I Алифатические аминокислоты 1 Моноаминомонокарбоновые кислоты
Глицин (α-аминоуксусная кислота)		гли
Аланин (α-аминопропионовая кислота)		ала
Валин (α-аминоизовалериановая кислота)		вал
Лейцин (α-аминоизокапроновая кислота)		лей
Изолейцин (α-амино-β-метил-валериановая кислота)		илей
Серин (α-амино-β-окси-пропионовая кислота)		сер
Треонин (α-амино-β-оксимасляная кислота)		тре
2 Диаминомонокарбоновые кислоты
Лизин (α,ε-диаминокапрновая кислота)		лиз
Аргинин (α-амино-β-гуанидин-валериановая кислота)		арг
Продолжение табл.1
3 Моноаминодикарбоновые кислоты
Аспарагиновая (аминоянтарная кислота)		асп
Аспарагин (амид аспарагиновой кислоты)		асн
Глутаминовая (α-аминоглутаровая кислота)		глу
Глутамин (амид глутаминовой кислоты)		глн
4 Серосодержащие аминокислоты
Цистеин (α-амино-β-тио-пропионовая кислота)		цис
Метионин (α-амино-γ-метил-тиомасляная кислота)		мет
II Ароматические аминокислоты
Фенилаланин (α-амино-β-фенил-пропионовая кислота)		фен
Тирозин (α-амино-β-гидрокси-фенилпропионовая кислота)		тир
Продолжение табл.1
III Гетероциклические аминокислоты
Пролин (пирролидин-α-карбоновая кислота)		про
Триптофан (α-амино-β-индолил-пропионовая кислота)		три
Гистидин (α-амино-β-имидазолил-пропионовая кислота)		гис

Существуют универсальные цветные реакции, которые дают все белки (биуретовая и нингидриновая). Кроме того, имеются специфические реакции, которые обусловлены на­личием только определенных аминокислот в молекуле белка (ксантопротеиновая, Миллона, Фоля и др.); многие из них весьма чувствительны и высокоспецифичны, что позволяет открывать ничтожные количества той или иной индивидуаль­ной аминокислоты в составе сложных смесей, биологических жидкостях, гидролизатах белков и т.п. На основании неко­торых цветных реакций разработаны методы количествен­ного определения белков и аминокислот.

Лабораторная работа 1. Биуретовая реакция

Биуретовая реакция получила свое название от произ­водного мочевины – биурета, образующегося при нагревании мочевины с отщеплением от нее аммиака:

Биуретовая реакция открывает в белке пептидную связь

(она имеется и в биурете). Однако эту реакцию способны давать вещества, содержащие не менее двух пептидных свя­зей.

При добавлении к сильно щелочному раствору белка или продукту его неполного гидролиза сульфата меди, образуются комплексные соединения меди, окрашенные в красно-фиолетовый или си­не-фиолетовый цвет. Интенсивность окраски зависит от дли­ны пептида.

Биуретовую реакцию дают аспарагин (амид аспарагиновой кислоты) и аминокислоты гистидин, треонин и серии.

Группа, образующая пептидную связь в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной енольной форме:

При избытке щелочи происходит диссоциация ОН-группы, появляется отрицательный заряд, с помощью которого кислород взаимодействует с медью; кроме того, медь обра­зует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их неподеленных электронных пар. Возникающий таким об­разом комплекс очень стабилен.

1 Цель работы - провести биуретовую реакцию, которая обнаруживает пептидные связи в белке

Приборы и материалы

Белок 1 %

Едкий натр 10 %

Сернокислая медь 1 %

Описание работы

К пяти каплям 1 % раствора белка прибавляют три капли 10 % раствора едкого натра, одну каплю 1 % рас­твора сернокислой меди и перемешивают. Содержимое про­бирки приобретает сине-фиолетовый цвет.

Нельзя добавлять избыток сернокислой меди, поскольку синий осадок меди маскирует характерное фиолетовое окра­шивание биуретового комплекса белка.

Контрольные вопросы

1. Наличие какой связи в молекуле белка обеспечивает протекание данной цветной реакции?

2. Все ли белки дают данную цветную реакцию

3. От чего зависит интенсивность окраски в биуретовом методе?

1.2 Лабораторная работа 2. Нингидриновая реакция на α-аминокислоты

Растворы белка, пептидов и аминокислот дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином при нагревании. Все аминокислоты можно рассматривать как С-замещенные про­изводные аминоуксусной кислоты. При окислении они рас­щепляются:

В качестве окислителей можно применить органическое соединение - нингидрин (трикетогидринденгидрат):

Трикетогидринден Нингидрин

Сначала нингидрин восстанавливается аминокислотой до ендиола:

1. Декарбоксилирование

2. Дезаминирование

3. Окисление

1.

Ендиол

Затем конденсируется с аммиаком и второй молекулой нингидрина, образуя краситель типа мурексида (пурпурный Руэмана), который в нейтральных и слабощелочных растворах существует в виде окрашенного иона (аниона). Окраска обусловлена наличием всине-фиолетовом Руэмана цепи конъюгации с ионными зарядами по концам цепи:

В настоящее время нингидриновая реакция исключитель­но широко используется как для открытия отдельных амино­кислот, так и для их количественного определения.

Сине-фиолетовый Руэмана на хроматограмме довольно быстро (в течение нескольких дней) разрушается. Чтобы из­бежать обесцвечивания пятен на хроматограмме, ее протас­кивают через насыщенный раствор азотнокислой меди в 90 % ацетоне. При этом сине-фиолетовый Руэмана превра­щается в комплексную медную соль красного цвета. В таком виде, хроматограмма может храниться несколько месяцев.

1 Цель работы- провести качественную реакцию с нингидриновым реактивом на α-аминокислоты

Приборы и материалы

Водяная баня

Электроплитка

Белок 1 %

Гидролизат белка

Аминокислота 2 %

Нингидрин 0,1 %

Описание работы

В 1-ю пробирку наливают пять капель 1 % раствора белка, во 2-ю – пять капель гидролизата белка, в 3-ю – 2 мл 2 % раствора аминокислоты. Во все три пробирки наливают пять капель 0,1 % водного раствора нингидрина и кипятят 1 – 2 мин. Наблюдают появление розово-фиолето­вого или сине-фиолетового окрашивания. Затем раствор си­неет.

Контрольные вопросы

1.Что выявляет нингидриновая реакция?

2.В чем принцип метода?