Биохимические процессы, протекающие при проращивании

Замоченный ячмень проращивают в токовых или пневматических солодовнях. В пневматических через слой проращиваемого зерна про­дувают воздух определенной влажности, температуры и интенсивно­сти аэрации. При этом в зерне протекают сложные морфологические и биохимические превращения. К морфологическим превращениям относят развитие зародыша и нарушение клеточной структуры эн­досперма, к биохимическим — активацию ферментов, превращение сложных веществ в простые и процесс дыхания.

При проращивании у зерна появляется зародышевый корешок (глазок), проникающий через плодовую, семенную оболочки и цветочные пленки в то место, где зерно было прикреплено к коло­су. Разрываются клетки зародышевого корешка, и появляется не­сколько новых корешков (ростки), которые, в свою очередь, по­крываются капиллярными волосками. Одновременно с этим начи­нает развиваться зародышевый листок (проросток, или стебелек), который прорывает плодовую и семенную оболочки и, увеличива-

Первый день

Второй-

третий

день

Четвертый-

пятый

день

Седьмой-восьмой

день

Рис. 22. Схема-растворения эндоспермапо дням проращивания зерна исоответствующим им днямразвития зародыша

ясь, продвигается между семенной оболочкой и цветочными плен­ками. Прометок должен развиваться только до определенной вели­чины, не достигая вершины зерна.

На рис. 22 показано растворение эндосперма ячменя по дням про­ращивания 'зерна.

В начале'развития питание зародыша зерна обеспечивается за счет небольшого запаса питательных веществ (сахара, аминосоединения, минеральные вещества и др.), которые находятся вокруг зародыша и, растворяясь в воде, поступившей в зерно при замачивании, пита­ют его. Для дальнейшего развития зародыша требуется постоянный приток нлзкомолекулярных питательных веществ, образованию ко­торых способствуют гидролитические, ферментативные процессы.

Активация ферментов и расщепление резервных веществ эндоспер­ма ячменя становятся возможными лишь при наличии в зерне свобод­ной влаги. Под действием ее крахмал, белки, пектиновые вещества и др. Набухают и переходят в состояние, в котором легко атакуются ферментами. Клеточные стенки становятся более проницаемыми.

По мере проращивания часть крахмальных зерен эндосперма и вешества_; связывающие их, растворяются. Эндосперм становится на­столько мягким, что легко растирается между пальцами. Такое раз­рыхление зерна при солодоращении изменяет его плотность. Обычно плотность массы зерна ячменя составляет 1,3 г/см³ и оно тонет в воде. Плотность хорошо разрыхленных (растворенных) зерен солода мень­ше единицы. Поэтому при погружении в воду они плавают. Зерно плохо растворенного (стекловидного) солода тонет.

При соблюдении технологического режима солодоращения рост­ки зародыша достигают 1,5—2-кратной длины зерна. Зародыш листа (стебелек) с зачатками листьев, располагающийся под цветочными

пленками в виде язычка, достигает полной длины зерна. Если не прекратить проращивание зерна, то зародышевый листок прорвется наружу и образует проростки белого цвета. У тонкопленчатых ячме­ней цветочные пленки прорываются легче, поэтому проростки могут появиться и на ранней стадии солодоращения.

На морфологические изменения зерна и на глубину его растворе­ния влияет интенсивность аэрации ячменя при проращивании. Сла­бая аэрация замедляет рост корешков, и растворение эндосперма протекает быстрее. Интенсивная аэрация способствует росту кореш­ков и листовой части зародыша, но при этом усиливается дыхание и расходуется больше питательных веществ.

При высокой температуре и влажности аэрируемого воздуха и низкой влажности зерна рост зародыша усиливается, но ослабляются растворение эндосперма и поступление питательных веществ к заро­дышевому листку (проростку). В результате этого получается солод с длинными и тонкими корешками.

Активация и образование ферментов. В спелом зерне меньшая часть ферментов находится в активном состоянии, а большая часть связана с белками и поэтому не активна. При прорастании зерна белки под действием протеолитических ферментов расщепляются, и связанные с ними ферменты переходят в свободное, активное состояние. В пер­вую очередь растворяется белковое окружение крахмальных зерен. Это позволяет открыть доступ к их гемицеллюлозным стенкам. Дей­ствие гемицеллюлаз делает доступным содержимое крахмальных зе­рен для воздействия а-амилазы. Накопление ферментов происходит не только в результате перехода их в свободное состояние, но и в результате новообразования в алейроновом слое и зародыше. Значи­тельную роль в этом играет гибберелловая кислота (ГК) — ростовое вещество, образующаяся в прорастающем зерне. Она поступает из зародыша к щитку и затем к алейроновому слою, где вызывает обра­зование и активацию ферментов. То есть ГК является индуктором образования ферментных систем (рис. 23).

Образовавшиеся из высокомолекулярных веществ под действием ферментов низкомолекулярные вещества из эндосперма через щиток

а — р-амилаза; 6 - эндо-р-глюканаза; в — а-амилаза; г — прогеаза; д - фосфатаза; гк — гибберелловая кислота; 1 — корешки; 2 - цветковая (мякинная) оболочка; 3 - листок; 4 - плодовая (семенная) оболочка; 5 - базальный слой; 6 - алейроновый слой; 7 - зародыш листа; 8 - эндосперм; 9 - клетки эпителия; 10 - зародыш; 11 - щиток; 12 - эародаш корня.

Рис. 23. Схема образования ферментов в при

поступают к зародышу, где служат основой для образования новых веществ, а также для участия в процессе дыхания.

В непроросшем зерне а-амилаза не определяется аналитическими методами, а при прорастании, по-видимому, частично переходит из связанного в активное состояние и частично образуется вновь. р-Амилаза в покоящемся зерне содержится в свободной и связанной формах, на вторые-пятые сутки проращивания зерна количество ак­тивной (3-амилазы значительно увеличивается. Растет активность и других ферментов.

Активность ферментов в солоде и скорость их накопления при проращивании зависят от сорта и состава ячменя, способа проращи­вания, интенсивности аэрации и температуры процесса. При солодо-ращении активность амилолитических ферментов возрастает в 3-5 раз, протеолитических — примерно в 2,5 раза, фосфатаз — в 5—7 раз, а-глюкозидазы - в 2 раза.

Во время проращивания в солоде увеличивается активность по-лифенолоксидазы, но в готовом солоде сохраняется только часть ее активности, окисляющей антоцианогены.

Активирование и образование ферментов идет параллельно с жизнедеятельностью зародышевого корешка.

Ферменты могут действовать при высоких температурах и в отсут­ствие кислорода, когда зародыш погибает. Эту их способность ис­пользуют при солодоращении: сначала прорастающему зерну подают достаточно кислорода для образования ферментов, а затем подачу воздуха прекращают. При этом ферменты продолжают действовать, растворяя эндосперм, а зародыш почти не развивается. Это дает воз­можность уменьшать потери ценных веществ зерна.

Способность ферментов сохранять свою активность при высокой температуре используют при сушке солода. Повышая температуру в солодосушилке, зародыш убивают, почти не снижая активности фер­ментов. Поэтому при затирании ферменты продолжают свою работу.

Ферменты в зерне распределены неравномерно, большая часть их находится в зародыше, в эндосперме, прилегающем к щитку, и в периферийных частях зерна.

Дыхание зерна. В прорастающем зерне под действием ферментов начинается расщепление всех высокомолекулярных соединений (крахмала, белка и, др.) и превращение их в простые низкомоле­кулярные вещества, которые затем расходуются на рост зародыша. Проращивание зерна сопровождается интенсивным дыханием -потреблением кислорода и образованием диоксида углерода. Ос­новным материалом для дыхания служат углеводы, но в дыхании могут участвовать также кислоты, жиры, азотсодержащие веще­ства. Все процессы при дыхании определяются и регулируются дей­ствием ферментов.

Различают два вида дыхания: аэробное, когда реакция проте­кает при избытке кислорода, и анаэробное, вызываемое недостат-

ком кислорода, повреждением растительных тканей и инактива­цией дыхательных ферментов.

Баланс химических превращений углеводов при аэробном дыха­нии происходит по следующим схемам:

с ₂н₂₂о_п + н₂о = 2С₆н₁₂о₆;

Мальтоза Глюкоза

С₆Н_ПО₆+ 6О₂ =* 6СО₂ +6Н₂0 + 2822 кДж/г-моль (674 ккал).

По этой схеме мальтоза (С_]гН_дО_и), образовавшаяся из крахмала под действием ферментов превращается в глюкозу (С₆Н₁₂О₆), кото­рая окисляется до диоксида углерода и воды с выделением теплоты.

При недостаточном притоке воздуха во время замачивания и про­ращивания нарушается естественное дыхание зерна, что наблюдает­ся, например, при проращивании зерна в высоком слое, когда в массе зерна накапливается диоксид углерода и повышается темпера­тура. Это вызывает анаэробное дыхание, протекающее в соответствии с суммарным уравнением спиртового брожения:

С₆Н_|20₆ = 2С₂Н₅ОН + 2СО₂ + 234,5 кДж/г-моль (56 ккал). Глюкоза Этиловый спирт

В последней реакции на каждую молекулу глюкозы, израсходо­ванную на дыхание, выделяется в 12 раз меньше теплоты и в 3 раза меньше диоксида углерода, чем при аэробном дыхании. Поэтому, чтобы обеспечить себя необходимой энергией, зерно должно расхо­довать намного больше сахара, чем при аэробном дыхании. При хо­рошей аэрации обеспечивается более эффективное в энергетическом отношении аэробное дыхание и снижается расход углеводов, затра­чиваемых на анаэробное дыхание.

То есть повышение температуры зерна и приток кислорода возду­ха усиливают интенсивность дыхания, а накапливающийся диоксид углерода замедляет дыхание.

Подавление анаэробного дыхания в присутствии кислорода и развитие аэробного дыхания в этих условиях получило название эффекта Постера.

В зависимости от интенсивности аэрации в прорастающем зерне, кроме диоксида углерода всегда образуется некоторое количество орга­нических кислот, спиртов и эфиров, благодаря чему свежепророс­ший солод приобретает специфический запах, напоминающий запах свежих огурцов.

При чистом аэробном дыхании дыхательный коэффициент, пред­ставляющий собой отношение объемов выделившегося диоксида уг­лерода и поглощенного кислорода, будет равен единице.

На разных стадиях замачивания и проращивания ячменя величина дыхательного коэффициента неодинакова. В начале замачивания яч­меня дыхательный коэффициент больше единицы, т. е. в это время диоксида углерода образуется больше, чем потребляется кислорода. В конце солодоращения, наоборот, дыхательный коэффициент меньше

единицы, т. е. кислорода потребляется больше, чем выделяется диок­сида углерода.

Потери экстрактивных веществ зерна на дыхание значительны, величина их зависит от условий проращивания и сорта ячменя.

В табл. 8 показаны потери сухих веществ ячменя по дням прора­щивания.

Таблица 8

Длительность проращивания, сут	Температура проращивания, "С	Потери сухих веществ ячменя, %
на дыхание	на ростки
Первые	14,5	1,08	-
Вторые		1,70	0,45
Третьи		1,99	0,84
Четвертые		0,99	1,07
Пятые		0,61	1,06
Шестые		0,51	0,13
Седьмые		0,21	0,02

Наибольшие потери экстрактивных веществ наблюдаются на тре­тьи сутки проращивания, а затем они начинают уменьшаться. В кон­це цикла потери в 5 раз меньше, чем в первые сутки.

Практически установлено, что для получения солода с хорошей растворимостью, высокой ферментативной активностью и минималь­ными потерями сухих веществ процесс солодоращения должен про­текать медленно, при возможно низких температурах.

Превращение углеводов. В непроросшем зерне основное количество углеводов находится в нерастворенной форме. Небольшое количество растворимых сахароз (около 2%), содержащееся в зародыше, расходу­ется в начале проращивания, а затем потребность в питательных веще­ствах удовлетворяется благодаря реакциям расщепления высокомоле­кулярных веществ, прежде всего крахмала. Крахмал содержится в клет­ках в виде круглых и овальных зерен, окруженных гемицеллюлозными мембранами и связанных между собой белковыми веществами (см. рис.3). Поэтому расщеплению крахмала предшествует расщепление гемицел-люлоз и белков соответствующими ферментами.

Крахмал на 80% состоит из амилопектина и на 20% из амилозы. Часть его расщепляется под действием амилолитических ферментов (а- и р-амилаз), разрывающих связь а-(1—4). ^-Амилаза воздействует на молекулу амилозы или амилопектина и отщепляет от цепи полиса­харида молекулы мальтозы вплоть до места, где цепь имеет ответвле­ние [а-(1-6)-связи]. а-Амилаза действует на внутренние связи и обра­зует декстрины, состоящие примерно из 6 глюкозных остатков. Обра­зующиеся декстрины становятся доступными для действия (5-амилазы. Мальтоза расщепляется (З-глюкозидазой до глюкозы.

Таким образом, в результате гидролиза крахмала образуется смесь олигосахаридов, декстринов и моносахаридов.

Ячмень и солод содержат ферменты, гидролюующие р-глюкан: эндо-р-глюканазу, вызывающую резкое снижение вязкости раство­ра р-глюкана за счет разрыва цепочки полисахарида изнутри, и экзо-р-глюканазу, последовательно отщепляющую от нередуцирующего конца молекулы полисахарида углевод целлобиозу. Для пивоварения наибольшее значение имеет эндо-р-глюканаза. При замачивании ак­тивность этого фермента не изменяется, а при проращивании нарас­тает и в готовом солоде она в 10—20 раз больше, чем в ячмене.

Часть Сахаров, образовавшихся при гидролизе крахмала, расходу­ется на дыхание и образование новых клеток в процессе развития зародыша.

Концентрация Сахаров в свежепроросшем солоде примерно в 3,5 раза больше, чем в исходном ячмене, а содержание крахмала к кон­цу проращивания ячменя становится на 4—6% меньше.

Изменение азотсодержащих веществ. При солодоращении ячменя высокомолекулярные азотистые соединения (белки) под воздействи­ем протеолитических ферментов претерпевают глубокие изменения. При этом снижается содержание водонерастворимого белка и повышается содержание водорастворимого белка и продуктов его ферментативного гидролиза (аминокислот и полипептидов). Считается, что в процессе солодоращения до 40% азотистых веществ становятся водораствори­мыми. В действительности белковых веществ распадается значительно больше, однако часть образующихся аминокислот расходуется на раз­витие зародыша, а часть снова превращается в водонерастворимые белковые соединения.

Протеолитические ферменты относятся к классу гидролаз, точ­нее, пептидгидролаз, они расщепляют сложные соединения на более простые с участием воды в соответствии с уравнением

H,C-CH-CO-NH-CH₃+H₃O=H₃C-CH-COOH + СН_ГСООН

NH₂ COOH NH₂ NH₂

Аланилглицин Алании Глицин

Таким образом, ферменты, разрывая в полипептидной цепочке пептидную связь (—CO-NH—), присоединяют по месту разрыва воду и образуют две аминокислоты.

Солод содержит 3 группы пептидгидролаз: аминопептидазы, кар-боксипептидазы, дипептидазы. Аминопептидазы действуют при на­личии в молекуле субстрата свободной а-аминной группы, расщеп­ляют пептиды и амиды, содержащие N-концевые аминокислоты. Карбоксипептидазы расщепляют в полипептидах пептидную связь, находящуюся рядом со свободной карбоксильной группой пептида. Дипептидазы катализирует гидролитическое расщепление дипепти-дов на свободные аминокислоты.

Протеолитические ферменты, называемые протеиназами (папаин), гидролизуют внутренние пептидные связи в молекулах белков и по­липептидов, поэтому носят название эндопептидаз.

При проращивании ячменя активность аминопептидазы увеличи­вается в 1,7—2 раза; карбоксипептидазы в 10—20 раз, по сравнению с ячменем. Дипептидаза наиболее активна в замоченном зерне, затем во время проращивания во второй стадии солодорашения ее актив­ность падает. Активность эндопептидазы на пятые сутки солодораще-ния увеличивается в 3—12 раз по сравнению с ячменем.

Глубина растворения высокомолекулярной фракции белковых ве­ществ влияет на качество солода и пива. При слабом растворении белков пиво плохо фильтруется и осветляется, а при понижении температуры в пиве появляется муть. Пиво, полученное из солода с сильным белковым растворением, имеет низкую пеностойкость, не обладает полнотой вкуса.

Показателем качественной оценки солода, точнее глубины распа­да белковых веществ, служит формольное число, т. е. число милли­граммов формольного азота в 100 г сухого вещества (СВ) солода (формольный азот — это аминный азот, определенный при исполь­зовании формалина). Солод, содержащий более 230 мг формольного азота, считается перерастворенным, 200—230 мг — очень хорошо ра­створенным, 180-200 мг - хорошо растворенным, ниже 180 мг -плохо растворенным.

Наиболее интенсивный распад белков совпадает с максимумом накопления и активности протеолитических ферментов (обычно на 5 сутки ращения). В результате солодоращения теряется около 11% сухих веществ зерна и до 13% белковых веществ.

Действие цитоиггических ферментов. В переходе структуры зерна в рыхлое состояние большую роль играют цитазы — цитолитические фементы, в состав которых входят целлюлазы, гемицеллюлазы, глю-каназы, ксиланазы, пектиназы и др. Они действуют, в основном, на вещества стенок клеток эндосперма. Под влиянием гемицеллюлазы стенки клеток эндосперма растворяются и становятся проницаемыми для других ферментов (оптимальные условия их действия рН 5 и температура 4УС), то есть крахмал и белок делаются доступными для амилаз и протеаз.

Гемицеллюлозу и гумми-вещества атакуют две группы фермен­тов: эндо-р-глкжаназа и экзо-р-глюканаза. Эндо-р-глюканаза, раз­рывая связи внутри молекулы fJ-глюкана, сильно снижает вязкость растворов и поэто\(у оказывают значительное влияние на технологи­ческие процессы пивоварения. При низкой вязкости пивного сусла ускоряется процесс его приготовления, а пониженное содержание р-глюкана приводит к повышению стойкости готового пива. Экзо-р-глюканаза отщепляет от концов молекул полисахаридов молекулы сахара. Во время солодоращения р-глюкан превращается в р-глюка-новые декстрины, растворы которых имеют более низкую вязкость,

затем в олигосахариды, включая целлобиозу, и так — до глюкозы. Меньшую часть гумми-веществ составляют пентозаны, которые под действием ферментов распадаются до редуцирующих Сахаров.

Оценить, насколько эффективно действуют цитолитические фер­менты солода, можно по снижению вязкости лабораторного сусла.

Изменение жиров. В зерне ячменя содержится около 2% жира, при проращивании количество его уменьшается за счет окисления и рас­щепления ферментом липазой на глицерин и карболовые кислоты. Жир разрушает пену в пиве, поэтому переход жира в пиво нежелателен.

Изменение рН и титруемой кислотности. Водная вытяжка ячменя имеет рН 6, свежепроросшего солода 6,25, но титруемая кислотность значительно повышается вследствие расщепления углеводов, белко­вых веществ и образования органических кислот (молочной, янтар­ной, яблочной, аминокислот). Кислотность повышается также в ре­зультате дезаминирования аминокислот, т. е. процесса, в котором от аминокислот отщепляются щелочные аминогруппы и они превраща­ются в оксикислоты.

Титруемая кислотность ячменя, солода (при титровании с фенол­фталеином) выражается в см³1 н раствора NaOH, израсходованного на титрование 100 см³ лабораторного сусла. Нормальная кислотность для ячменя составляет 7—11; для свежепроросшего светлого солода 10,5—15; темного 11,5—15,5; для сухого светлого солода 14—17,5, тем­ного 13,5—17 см³ на 100 г экстракта.

Изменение растворимого экстракта. Масса водорастворимых веществ при солодоращении (в результате ферментативных процессов) уве­личивается примерно в 2 раза. Отдельные компоненты зерна раство­ряются по-разному. Так, из-за низкой активности амилаз крахмал при солодоращении расщепляется лишь на 4—6%. Зато при затирании (температура 65—75°С), когда достигается максимум активности ами­лаз, он расщепляется полностью. Белковые вещества при солодора­щении расщепляются больше, чем при затирании, так как протеоли-тические ферменты имеют более низкий температурный оптимум.