Термолабильность ферментов

Скорость химических реакций зависит от температуры, поэтому катализируемые ферментами реакции также чувствительны к изменениям температуры. Установлено, что скорость большинства химических реакций повышается в два-четыре раза при повышении температуры на 10°С и, наоборот, снижается в два раза при понижении температуры на 10°С. Этот показатель получил название температурного коэффициента Q₁₀. Однако вследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента с соответствующим снижением скорости реакции. Так, при температуре, не превышающей 45–50°С, скорость реакции увеличивается согласно теории химической кинетики. При температуре выше 50°С на скорость реакции большое влияние начинает оказывать тепловая денатурация белка-фермента, приводящая к полному прекращению ферментативного процесса.

a t опт

б

V

0 50 100 °C

а – повышение скорости реакции как функция температуры;

б – снижение скорости реакции как функция денатурации белка-фермента (стрелка указывает оптимум температуры)

Рисунок 2 – Зависимость скорости катализируемой ферментом реакции от температуры

Наибольшую активность ферменты проявляют в очень узком интервале температур где-то при 40-50°С для животных организмов и 40–60°С для растительных организмов, в этих условиях скорость реакции оказывается максимальной вследствие увеличения кинетической энергии реагирующих молекул. При низких температурах (0°С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Каждый фермент имеет свой температурный оптимум.

Следует отметить, что на термолабильность ферментов оказывают влияние время воздействия, концентрация субстрата, pH среды, а также в каком состоянии находится фермент. В кристаллическом виде ферменты более термоустойчивы.

Влияние кислотности среды

Важнейшим фактором, влияющим на активность ферментов, является реакция среды. В клетке одновременно присутствуют сотни различных ферментов, и каждый фермент наиболее активен в определённом узком интервале pH, называемым оптимумом pH. Оптимумы pH отдельных ферментов различаются. Например, максимальная активность пепсина, катализирующего расщепление белка, наблюдается при pH 1,5–2,0, а аргиназы, которая вызывает расщепление аминокислоты аргинина, – при pH 9,5–9,9. С изменением pH от оптимального значения в кислую или щелочную среду активность фермента снижается вначале медленно, а затем очень быстро, и часто такое инактивирование вскоре приобретает необратимый характер (рис. 3).

Оптимум pH действия большинства ферментов лежит в слабокислой или нейтральной реакции среды.

Таблица 2 – Оптимальные значения pH для некоторых ферментов

Фермент	pH	Фермент	pH
Амилаза из солода	4,9 – 5,2	Катепсин B	4,5 – 5,0
Амилаза слюны	6,8 – 7,0	Папаин	5,0
Липаза	7,0 – 8,5	Уреаза	7,3 – 7,9

pH опт

V

pH

V – скорость реакции

Рисунок 3 – Зависимость скорости биохимической реакции от pH среды

Согласно современным представлениям, влияние изменений pH среды на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (в частности, COOH-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, NH₂-группы лизина и т.д.). При резких сдвигах от оптимума pH среды ферменты могут подвергаться конформационным изменениям, приводящим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда молекулы фермента. При изменении pH нарушается оптимальное соотношение ионизируемых и не ионизируемых групп (соответствующее наибольшей активности фермента), что сказывается на третичной структуре белка и строении его активного центра. Кроме того, концентрация [H⁺] оказывает влияние на ионизацию субстрата и ионизацию кофактора, что также влияет на скорость течения реакции.

Концентрация фермента

Скорость ферментативных реакций зависит от количества фермента в среде. Когда в среде субстрата достаточно, скорость ферментативной реакции возрастает пропорционально увеличению количества фермента. Графически это выглядит следующим образом (рис. 4.):

V

V- скорость реакции

С- концентрация фермента

С

Рисунок 4 – Зависимость скорости реакции от концентрации фермента

Эта зависимость справедлива только в определённых условиях, например, в начальный период ферментативной реакции, т.к. в этот период практически не происходит обратной реакции, а концентрация продукта оказывается недостаточной для обратимости реакции. Именно в этом случае скорость реакции (точнее, начальная скорость реакции) будет пропорциональна концентрации фермента.

Концентрация субстрата

Скорость ферментативной реакции в сильной степени зависит от концентрации субстрата в среде. При низкой концентрации субстрата скорость реакции возрастает пропорционально его концентрации. Однако по мере увеличения концентрации эта пропорциональность нарушается, скорость реакции растёт всё медленнее. Происходит насыщение фермента субстратом, при этом молекулы фермента находятся в форме ES (полное насыщение), скорость реакции становится максимальной (V_m). Очевидно, что при полунасыщении (т.е. когда половина молекул фермента находится в форме ES) скорость реакции равна ½V_m. В этом заключается ещё одна особенность ферментативных реакций, не свойственная реакциям, протекающим в отсутствии ферментов. Если ещё дальше повышать концентрацию субстрата, то скорость реакции достигнет постоянного уровня, становится постоянной, не зависящей от концентрации субстрата. В этих условиях фактором, лимитирующим скорость ферментативной реакции, становится концентрация фермента в среде.

Изучение влияния концентрации субстрата на скорость ферментативных реакций позволило Л. Михаэлису и Ментен создать основы теории ферментативной кинетики.Они вывели классическое уравнение, описывающее гиперболическую зависимость в координатах V-[S]; при увеличении концентрации субстрата скорость ассиметрически стремится к V_m:

Одним из основных выводов этой теории является установление константы Михаэлиса, графическое изображение которой представлено на рис.5. Если скорость реакции при высоких концентрациях субстрата достигает некоторой максимальной величины V_m, то концентрация субстрата [S], при которой V=V_m/2, называется константой Михаэлиса K_m, т.е. K_m=[S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от максимальной.

Более низкие значения K_m означают, что ферментативный катализ происходит более интенсивно.

V

V_m/2 V_m

S

V – скорость реакции

K_m – концентрация субстрата,

Рисунок 5– Графическое изображение константы Михаэлиса

Таблица 3 – Значение констант Михаэлиса – Ментен (Кm)для катализа ферментом гексокиназой фосфорилирования сахаров.

Субстрат	Кm, моль/л	Субстрат	Кm, моль/л	Субстрат	Кm, моль/л
Глюкоза	8×10-6	Аллоза	8×10-3	Манноза	8,5×10-6

Как следует из данных таблицы 5, количество глюкозы, необходимое для 50%-го насыщения фермента, в тысячу раз меньше, чем необходимое для 50%-го аллозой. Следовательно, фермент предпочтительнее взаимодействует с глюкозой – он более специфичен к ней (реакция протекает тем быстрее, чем ниже К_m). К_mдля маннозы практически равен К_mдля глюкозы. Сравнивая структуру субстратов, можно видеть, что отличие аллозы от глюкозы и маннозы, так существенно сказавшееся на величине К_m, и, следовательно, скорости реакции фосфорилирования, обусловлено пространственной ориентацией ОН-группы у третьего (сверху) атома углерода и активного центра фермента, по которому идет образование фермент-субстратного комплекса.