Мультиферментные комплексы

Мультиферментные комплексы это надмолекулярные образования которые включают, несколько ферментов и коферментов. Они катализируют последовательные этапы реакции преобразования одного субстрата. Примером мультиферментов являются реакции окисли тельного декарбоксилирования αкетокислот (пирувата и αкетоглутарата) под влиянием пи руватдегидрогеназы и αкетоглутаратдегидрогеназы. Например пируватдегидрогеназный комплекс включает 3 фермента и использует 5 коферментов

Биологическое значение мультиферментных комплексов состоит в том, что благодаря их существованию облегчается перенос реагирующих веществ между отдельными фермен тами и коферментами, что ускоряет протекание реакций. Мультиферментные комплексы, как правило, формируются на мембранах путем самосборки.

Энзимодиагностика заболеваний.

Энзимодиагностика (энзим[ы] + греч. diagnostikos способный распознавать) методы диагностики болезней, патологических состояний и процессов, основанные на определении активности энзимов (ферментов) в биологических жидкостях. В особую группу выделяются иммуноферментные диагностические методы, состоящие в применении антител, химически связанных с каким-либо ферментом, для определения в жидкостях веществ, образующих с данными антителами комплексы антиген — антитело.

Использование энзимных тестов является важным критерием в распознавании врожденных энзимопатий, характеризующихся специфическими нарушениями обмена веществ и жизнедеятельности в связи с отсутствием или недостатком того или иного фермента.

Энзимопатии.

В основе многих заболеваний лежат нарушения функционирования ферментов в клетке - энзимопатии. Различают первичные (наследственные) и вторичные (приобретённые) энзимопатии. Приобретённые энзимопатии, как и вообще протеинопатии, по-видимому, наблюдают при всех болезнях.

При первичных энзимопатиях дефектные ферменты наследуются, в основном, по аутосомнорецессивному типу. Гетерозиготы, чаще всего, не имеют фенотипических отклонений. Первичные энзимопатии обычно относят к метаболическим болезням, так как происходит нарушение определённых метаболических путей.

Вещество А в результате последовательных ферментативных реакций превращается в продукт Р. При наследственной недостаточности какого-либо фермента, например фермента Е3, возможны разные нарушения метаболических путей:

Нарушение образования конечных продуктов. Недостаток конечного продукта этого метаболического пути (Р) (при отсутствии альтернативных путей синтеза) может приводить к развитию клинических симптомов, характерных для данного заболевания:

Клинические проявления. В качестве примера можно рассмотреть альбинизм. При альбинизме нарушен синтез в меланоцитах пигментов - меланинов. Меланин находится в коже, волосах, радужке, пигментном эпителии сетчатки глаза и влияет на их окраску. При альбинизме наблюдают слабую пигментацию кожи, светлые волосы, красноватый цвет радужки глаза из-за просвечивающих капилляров. Проявление альбинизма связано с недостаточностью фермента тирозингидроксилазы (тирозиназы) - одного из ферментов, катализирующего метаболический путь образования меланинов.

Накопление субстратов-предшественников. При недостаточности фермента Е3 будут накапливаться вещество С, а также во многих случаях и предшествующие соединения. Увеличение субстратов-предшественников дефектного фермента - ведущее звено развития многих заболеваний:

Клинические проявления. Известно заболевание алкапгонурия, при котором нарушено окисление гомогентизиновой кислоты в тканях (гомогентизиновая кислота - промежуточный метаболит катаболизма тирозина). У таких больных наблюдают недостаточность фермента окисления гомогентизиновой кислоты - диоксигеназы гомогентизиновой кислоты, приводящей к развитию заболевания. В результате увеличиваются концентрация гомогентизиновой кислоты и выведение её с мочой. В присутствии кислорода гомогентизиновая кислота превращается в соединение чёрного цвета - алкаптон. Поэтому моча таких больных на воздухе окрашивается в чёрный цвет. Алкаптон также образуется и в биологических жидкостях, оседая в тканях, коже, сухожилиях, суставах. При значительных отложениях алкаптона в суставах нарушается их подвижность.

Нарушение образования конечных продуктов и накопление субстратов предшественников. Отмечают заболевания, когда одновременно недостаток продукта и накопление исходного субстрата вызывают клинические проявления.

Клинические проявления. Например, у людей с болезнью Гирке (гликогеноз I типа) наблюдают снижение концентрации глюкозы в крови (гипогликемия) в перерывах между приёмами пищи. Это связано с нарушением распада гликогена в печени и выходом из неё глюкозы вследствие дефекта фермента глюкозо-6-фосфатфосфатазы (см. раздел 7). Одновременно у таких людей увеличиваются размеры печени (гепатомегалия) вследствие накопления в ней не используемого гликогена.

И.Ф.

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ (от лат. immobiiis - неподвижный), препараты ферментов, молекулы к-рых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом полностью или частично свои каталитич. св-ва. Иммобилизованные ферменты обычно не раств. в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитич. р-ции, ингибиторов и активаторов. Существует неск. осн. способов иммобилизации ферментов: 1) путем образования ковалентных связей между ферментом и матрицей; 2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присут. фермента, к-рый при этом оказывается включенным в сетку полимера - обычно геля; 3) благодаря электростатич. взаимод. противоположно заряженных групп фермента и матрицы; 4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу; 5) связыванием фермента и матрицы в результате невалентных взаимод. - гидрофобных, с образованием водородных связей и др.; 6) инкапсулированием - созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, напр., включением фермента в липосомы; 7) сшиванием молекул фермента между собой, напр., глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой к-ты. Особый случай иммобилизации проведение ферментативных р-ций в двухфазной системе, когда фермент находится в водной фазе, а субстраты и продукты р-ции распределяются между орг. и водной фазами, что позволяет в зависимости от коэф. распределения в-в между фазами сдвигать равновесие р-ции в нужную сторону; диспергирование фаз увеличивает пов-сть их раздела и тем самым улучшает доступ субстрата к ферменту. Среди способов иммобилизации наиб. распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель. В первом случае в качестве матрицы обычно используют целлюлозу, декстрановые гели (сефароэу, агарозу), микропористые стекла или кремнеземы, а также синтетич. полимеры. Матрицу при ковалентной иммобилизации ферментов обычно предварительно активируют, обрабатывая, напр., бромцианом, азотистой к-той или цианурхлоридом. Благодаря этому она становится носителем активных группировок, к-рые способны вступать в р-цию сочетания, взаимод. с группами NH2, ОН, СООН. Во втором случае в качестве гелеобразующего полимера используют полиакриламид. На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно неск. способами. Так, при фиксации ферментов ковалентными связями между их молекулами и матрицей обычно возникают также нековалентные взаимодействия. Известны способы предварит. хим. модификации молекул фермента низкомол. в-вами или р-римыми полимерами, имеющими заряженные группировки, что изменяет у таких модифицир. белков электростатич. заряд молекулы и позволяет достаточно прочно сорбировать их на ионообменных смолах. При всех типах иммобилизации матрица, взаимодействуя с ферментом, может инактивировать последний или создавать пространств. затруднения для доступа субстрата к активному центру. При ковалентном связывании фермента для предотвращения отрицат. влияния матрицы между ней и молекулой фермента вводят разобщающую цепь атомов - спейсер (наз. также "вставкой" или "ножкой"). Кроме того, часто стремятся использовать для иммобилизации гидрофильные матрицы, создающие вблизи фермента более естеств. микроокружение. При иммобилизации ферментов необходимо, чтобы активные группы матрицы не блокировали каталитич. центр фермента, а условия иммобилизации не приводили к потере его активности. Определенные ограничения на способ иммобилизации налагают и особенности субстрата. Так, в случае высокомол. субстратов нельзя использовать методы инкапсулирования или включения фермента в гель. Если матрица несет на себе заряды, то заряд субстрата влияет на кинетич. параметры р-ции: разноименные заряды на носителе и субстрате увеличивают скорость р-ции, катализируемой иммобилизованными ферментами, одноименные заряды ее снижают и м. б. причиной полной потери активности препарата. Заряды носителя и субстрата влияют также на величину рН, при к-рой скорость ферментативной р-ции максимальна. Важную роль играет распределение субстрата между фазами иммобилизованного фермента и р-ра. Ограниченная доступность субстрата к активному центру фермента может привести к изменению специфичности последнего. Особенно это Характерно для высокомол. субстратов, к-рые из-за малого коэф. диффузии медленно переходят в фазу иммобилизованного фермента, что приводит к относит. увеличению скоростей др. р-ций с участием субстратов меньших размеров. В нек-рых случаях возможно также изменение направления р-ции. Так, фермент эндополигалактуроназа, катализирующий расщепление полигалактуроновой к-ты в середине молекулы, после иммобилизации отщепляет низкомол. фрагменты от концов молекулы. Существ. влияние на кинетику р-ций, катализируемых иммобилизованными ферменами, оказывают два диффузионных барьера - внешний и внутренний. Первый обусловлен наличием тонкого неперемешиваемого слоя р-рителя вокруг частицы иммобилизованного фермента (слоя Нернста). Толщина этого слоя зависит от скорости перемешивания. Поэтому увеличение последней или скорости тока р-ра в колонке с иммобилизованным ферментом увеличивает скорость ферментативной р-ции. Внутр. диффузионный барьер возникает вследствие ограничения своб. диффузии субстрата внутри сетки полимерной матрицы. Иммобилизация ферментов создает ряд преимуществ. К ним относятся: более высокая стабильность ферментных препаратов, возможность их удаления из реакц. среды и его повторного использования, а также возможность создания непрерывных процессов на ферментных колонках. Важное значение имеет относит. стабильность иммобилизованных ферментов к денатурирующим воздействиям - нагреванию, действию агрессивных сред, автолизу и др. Последнему подвержены протеолитич. ферменты. Иммобилизация разобщает молекулы этих ферментов и полностью исключает такой процесс. Благодаря этому удалось изучить механизм образования протеолитич. фермента пепсина из его предшественника пепсиногена (при этом от последнего отщепляется пептид, состоящий из 42 аминокислотных остатков). Было показано, что эта р-ция катализируется самим пепсином. Иммобилизованные ферменты применяют в произ-ве L-аминокислот, 6-аминопенициллановой к-ты, из к-рой получают полусинтетич. пенициллины, в синтезе преднизолона, для удаления лактозы из продуктов питания, используемых больными с лактазной недостаточностью, в изготовлении ферментных электродов для экспресс-определения мочевины, глюкозы и др. в-в, для создания аппаратов "искусств. почка" и "искусств. печень", для удаления эндотоксинов, образующихся в процессе заживления ран и ожогов, при лечении нек-рых онкологии, заболеваний и др. Большое значение приобрели в клинич. и лаб. практике иммуноферментные методы анализа, в к-рых также используются иммобилизованные ферменты.