Количественное определение малонового диальдегида

Свободными радикалами (R^·) называют атомы, молекулы или структурные фрагменты молекул, имеющие на внешних орбиталях неспаренные электроны. В силу исключительно высокой реакционной способности радикалы могут взаимодействовать с различными молекулами, вызывая их повреждение. Малоновый диальдегид (МДА) – конечный продукт свободно-радикального окисления полиненасыщенных высших жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов биологических мембран. МДА – химически очень активное вещество, своими альдегидными группами взаимодействует с NH₂-группами белков, вызывая их необратимую денатурацию.

Активация в клетке пероксидных и свободно-радикальных процессов – это один из факторов патогенеза атеросклероза, ишемической болезни сердца, инфаркта, инсульта, язвенной и ожоговой болезни, онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваний, синдрома адаптационного перенапряжения и хронической усталости, диабета. Синдром пероксидации проявляется также при низком уровне антиоксидантов, стрессе любого происхождения, действии синтетических лекарств и ксенобиотиков, гиподинамии, старении организма, избыточном потреблении в пищу жиров и углеводов, гипоксических состояниях, воздействии вибрации, электромагнитных полей, радиоактивного и ультрафиолетового излучений.

Цель работы

Определить содержание МДА в сыворотке крови

Принцип метода

МДА реагирует с тиобарбитуровой кислотой. При этом образуется окрашенное соединение - триметиловый комплекс. Оптическую плотность окрашенного раствора определяют на ФЭК при 532 нм и рассчитывают концентрацию МДА исходя из молярного коэффициента экстинции триметилового комплекса.

Выполнение работы

Студентам выдается готовый лизат, приготовленный следующим образом: к 2 мл крови добавляют 0.2 мл 0.1% раствора Тритон Х-100 и оставляют на 30 минут при 0°С. МДА определяют в образовавшемся лизате по ниже приведённой схеме:

Реактивы и этапы	Пробы
Опыт	Контроль
Лизат, мл	0,5	–
Физиологический раствор, мл	1,5
Трихлоруксусная кислота (30% ТХУ), мл
Инкубируют 15 минут при 0°С
Центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин
Надосадочную жидкость аккуратно сливают в помеченные стеклянные пробирки, отбирают из них точно по 2 мл надосадочной жидкости и добавляют:
Тиобарбитуровая кислота (0,5%), мл
Кипятят 15 минут (осторожно!)
Охлаждают до 15–25 °С
Фотометрируют против воды (l=532 нм, толщина кюветы 1 см ) D532
Dоп – Dк

Расчет результатов

Концентрацию МДА (C_x) вычисляют по формуле:

C_x = 76,92 · (Dоп – Dк) мкмоль/л

Примечание: 76,92 – рассчитывается исходя из молярного коэффициента экстинкции триметилового комплекса (1,56 ^. 10⁵ моль^-1см^-1) и разведения.

Выводы:

Тестовые задания по теме: «Обмен липидов»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. В организме животных встречаются в основном жирные кислоты с четным числом углеродных атомов.

2. Фосфатидилхолин содержит остаток серина в составе своей молекулы.

3. Карнитин осуществляет транспорт активированных жирных кислот в митохондрии.

4. Желчные кислоты синтезируются в печени.

5. В биосинтезе фосфатидилхолина участвует ЦТФ.

6. В состав парных желчных кислот может входить глицин.

7. Синтезируются ли в организме гормоны липидной природы?

8. Велико ли содержание холестерина в хиломикронах?

9. Может ли глицерин превращаться в диоксиацетонфосфат?

10. Нужен ли восстановленный НАДФН (Н⁺) для биосинтеза холестерина?

11. Является ли скавален циклическим соединением?

12. Может ли ацетон образоваться из ацетоуксусной кислоты?

13. Ацетил-КоА - единственный источник образования ацетоновых тел в организме.

14. Ацетоацетат является дополнительным источником энергии в клетках печени.

15. Донором метильных групп для синтеза фосфатидилхолина является метионин.

16. Ненасыщенные жирные кислоты синтезируются значительно быстрее, чем насыщенные.

17. НАДФН (Н⁺) является коферментом β-гидрокси-β-метилглутарил-КоА- редуктазы.

18. Энергетический выход полного окисления глюкозы меньше по сравнению с окислением капроновой кислоты.

19. Является ли фосфатидная кислота общим метаболитом в синтезе триацилглицеролов и фосфатидилхолина?

20. Активируется ли липаза жировой ткани цАМФ?

21. Являются ли пальмитоил-КоА и серин источником синтеза сфинголипидов?

22. Активирует ли адреналин липолиз в жировой ткани?

23. Может ли ацетил-КоА превращаться в глюкозу в организме человека?

24. Ингибирует ли малонил-КоА карнитиновый транспорт высших жирных кислот в митохондрии?

2) Выбрать один правильный ответ

2.1.

Факторы, тормозящие липолиз в жировой ткани: 1. катехоламины и соматотропин 2. глюкокортикоиды 3. стресс, физическая нагрузка, голодание 4. глюкагон и кортикотропин 5. инсулин и простагландины

В синтезе фосфатидилхолина принимает участие: 1. цистеин 2. метионин 3. треонин 4. глицин 5. аланин

2.2.

Участник биосинтеза жирных кислот: 1. карнитин 2. биотин 3. сфингозин 4. церулоплазмин 5. ФАДН2

Конечный продукт действия синтазы жирных кислот: 1. бутирил-КоА 2. бутирил-АПБ 3. пальмитиновая кислота 4. стеариновая кислота 5. пальмитоил-КоА

3) Установить соответствие Х (цифра) и Y(буква):

СО₂ + Х Малонил- КоА

Х	Y
1. Сукцинил-КоА 2. Ацетил -КоА 3. Ацетоацетил-КоА	А. Ацил-КоА-дегидрогеназа Б. Кетоацил-АПБ-редуктаза В. Ацетил-КоА-карбоксилаза

5.5. Коллоквиум по теме «Обмен липидов»

Вопросы, для самостоятельной подготовки

1. Механизм β-окисления высших жирных кислот. Роль КоА, карнитина и АТФ в этом процессе.

2. Особенности окисления высших жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов.

3. Превращения глицерина. Энергетический эффект полного аэробного окисления молекулы глицерина.

4. Биосинтез высших жирных кислот.

5. Синтез фосфатидилхолинов.

6. Ацетоновые (кетоновые) тела, синтез, биологическая роль. Значение определения ацетоновых тел в моче для диагностики сахарного диабета.

7. Холестерин, его биологическая роль. Основные этапы синтеза. Количественное определение холестерина в сыворотке крови.

8. Транспорт липидов в организме. Липопротеины сыворотки крови.

9. Связь обмена липидов и углеводов.

10. Пероксидное окисление липидов. Роль цитохрома Р-450 в микросомальном окислении гидрофобных соединений.

Варианты письменной части коллоквиума

1. Указать примерный белково-липидный состав в %: I. ЛПВН II. ЛПНП III. ЛПОНП IV. хиломикронов 2. Написать реакции: I. биосинтеза ацетоновых тел II. β-окисления олеиновой кислоты III. восстановления в биосинтезе ВЖК (указать источники кофермента) IV. биосинтеза сфингомиелина 3. Какой основной метаболический процесс дает энергию: I. в печени? II. в сердечной мышце? III. в эритроцитах? IV. в мозге?

4. Сколько молекул АТФ максимально можно получить и каким путем при полном окислении одной молекулы: I. триолеата? II. олеопальмостеарата? III. олеодистеарата? IV. стеаропальмофосфатидной кислоты? 5. В каких атомах холестерина будет 14С из: I. 14С3-глюкозы? II. 14С4-глюкозы? III. 14С1-ГАФ? IV. 14С1-пирувата? 6. Какие атомы углерода могут включаться в глюкозу и глицерин из: I. малонил-АПБ? II. пальмитиновой кислоты? III. олеиновой кислоты? IV. стеариновой кислоты?

Варианты заданий на компьютерном тестировании

Инструкция к тесту: Выбрать все правильные ответы

1. Аллостерический фермент, регулирующий синтез ВЖК 1. ацетил-КоА-карбоксилаза 2. гексокиназа 3. фосфофруктокиназа 4. липаза ГМГ-синтаза 2. Содержание триацилглицеролов в ХМ составляет примерно 1. 10% 2. 20% 3. 30% 4. 50% 5. 80% 3. В переносе ацетил-КоА из митохондрии в цитоплазму участвует 1. цитрат 2. малат 3. карнитин 4. оксалоацетат 5. альбумин 4. Участники биосинтеза ВЖК 1. малонил-КоА 2. биотин 3. сфингозин 4. НАДФН(Н+) 5. ФАДН2 5. В образовании фосфатидилсерина могут участвовать 1. лецитин 2. ЦДФ-диацилглицерол 3. цистеин 4. S-аденозилметионин 5. серин 6. В состав биологических мембран входят 1. диацилглицеролы 2. жирные кислоты 3. холестерин 4. фосфолипиды 5. гликолипиды 7. Рециркуляция между печенью и кишечником характерна для 1. фосфолипидов 2. моноацилглицеринов 3. глицерина 4. лизофосфолипидов 5. желчных кислот 8. Антиатерогенными свойствами обладают 1. ХМ 2. ЛПВП 3. ЛПНП 4. ЛПОНП 5. холестериды 9. В митохондриях происходят следующие процессы 1. b-окисление жирных кислот 2. синтез цитрата 3. липолиз триацилглицеролов 4. синтез фосфолипидов 5. образование ацетоновых тел 10. Эйкозаноиды образуются из арахидоновой кислоты путем 1. липоксигенизации 2. метилирования 3. декарбоксилазным 4. карбоксилазным 5. циклооксигенации 11. Ингибируют липолиз триациглицеролов в адипоцитах 1. инсулин 2. катехоламины 3. простагландины 4. глюкокортикоиды 5. глюкагон 12. Из холестерина в организме человека могут синтезироваться 1. жирные кислоты 2. диацилглицеролы 3. желчные кислоты 4. половые гормоны 5. глюкокортикоиды 13. Общим метаболитом в синтезе ТАГ и фосфатидилхолина является: 1. фосфатидная кислота 2. фосфатидилинозитол 3. этаноламин 4. холин 5. серин 14. В лимфатическую систему кишечника диффундируют 1. ЛПНП 2. ЛПВП 3. ЛПОНП и ЛПВП 4. ЛПНП и ЛПОНП 5. ХМ 15. Коферменты, участвующие в b-окислении жирных кислот 1. НАД + 2. НАДФ 3. ФАД 4. КоА 5. ТГФК 16. К группе эйкозаноидов относятся 1. простагландины 2. простациклины 3. тромбоксаны 4. лейкотриены 5. изопреноиды 17. В биосинтезе фосфатидилхолинов могут участвовать 1. холестерин 2. ЦДФ-холин 3. S-аденозилметионин 4. фосфатидилэтаноламин 5. ЦДФ-диацилглицерол 18. Фосфолипиды 1. лецитины 2. кардиолипины 3. ацилглицерол 4. церамиды 19. Липолиз в жировой ткани угнетается 1. адреналином 2. глюкагоном 3. тироксином 4. инсулином 5. кортикотропином 20. Ацетил-КоА-карбоксилазу тормозят 1. цитрат 2. АТФ 3. пальмитат 4. авидин 5. биотин 21. Уровень холестерина в крови возрастает при введении 1. инсулина 2. адреналина 3. соматотропина 4. глюкагона 5. глюкокортикоидов 22. Ацетил-КоА участвует в синтезе 1. глицерина 2. холестерина 3. пирувата 4. ацетоацетата 5. ВЖК 23. Коферментом в реакциях биосинтеза холестерина и ВЖК служит 1. НАДН(Н+) 2. ФАДН2 3. НАДФН(Н+) 4. ТПФ 5. ПФ 24. Сукцинил-КоА образуется в процессе 1. биосинтеза холестерина 2. окисления арахидоновой кислоты 3. в ЦТК 4. биосинтеза жирных кислот 5. биосинтеза сфинголипидов 25. Предшественник эйкозаноидов 1. пальмитат 2. арахинат 3. арахидонат 4. стеарат 5. олеат 26. Гормоны, активирующие гормончувствительную липазу в адипоцитах 1. адреналин и норадреналин 2. простагландины и инсулин 3. окситоцин и вазопрессин 4. тироксин и глюкокортикоиды 5. гормоны гипоталамуса 27. Липиды, содержащие остаток глицерина 1. цереброзиды 2. ганглиозиды 3. лецитины 4. сфинголипиды 5. кардиолипины

28. Внемитохондриальный синтез ВЖК аллостерически активирует 1. НАДФН(Н+) 2. АТФ 3. СО2 4. цитрат 5. авидин 29. Факторы, тормозящие липолиз в жировой ткани 1. катехоламины и соматотропины 2. стресс, физическая нагрузка, голодание, охлаждение 3. глюкагон и кортикотропин 4. инсулин и простагландины 30. В синтезе жирных кислот участвуют 1. НАД+ и ФАД 2. ЦТФ и УТФ 3. АПБ и НАДФН(Н+) 4. карнитин и фосфат 5. ПФ и ТПФ 31. В биосинтезе кетоновых тел и холестерина участвуют 1. малонил-КоА 2. сукцинил-КоА 3. b-гидрокси-b-метилглутарил-КоА 4. мевалонат 5. ацетил-КоА 32. Азотсодержащие липиды 1. каротины 2. витамины А, Е, К 3. лецитины 4. церамиды 5. триацилглицеролы 33. Атерогенными считают 1. ХМ 2. ЛПОВП 3. ЛПНП 4. ЛПВП 5. ЛПОНП 34. Витамин F представляют жирные кислоты 1. линолевая 2. линоленовая 3. арахидоновая 4. арахиновая 5. олеиновая 35. Ацетоновые тела 1. ацетил-КоА и сукцинил-КоА 2. ацетоацетат и b-оксибутират 3. ацетоацетил-КоА и пропионил-КоА 4. пируват и малат 36. Конечный продукт действия синтетазы жирных кислот 1. бутирил-КоА 2. бутирил-АПБ 3. пальмитиновая кислота 4. стеариновая кислота 5. олеиновая кислота 37. Коферменты, не участвующие в биосинтезе ВЖК 1. ФАД 2. НАД+ 3. биотин 4. НАДФН(Н+) 38. Ацетоновые тела синтезируются в 1. цитозоле 2. митохондриях 3. ядре 4. ЭПС 5. микросомах 39. В энтероцитах кишечника ресинтезируются 1. триацилглицеролы 2. жирные кислоты 3. желчные кислоты 4. кетоновые тела 5. фосфолипиды 40. Концентрация (в ммоль/л) общего холестерина в сыворотке крови в норме 1. 0,1 2. 1,0 3. 5,0 4. 7,0 5. 10,0 41. В состав желчи для обеспечения мицеллярной диффузии жирных кислот и моноациглицеролов должны входить 1. соли желчных кислот и холестерин 2. жирорастворимые витамины 3. желчные пигменты 4. липаза и колипаза 5. незаменимые жирные кислоты 42. В синтезе фосфолипидов специфически участвует нуклеозидтрифосфат 1. АТФ 2. ЦТФ 3. ГТФ 4. УТФ 5. ТТФ 43. Первый циклический продукт в биосинтезе холестерина 1. меванолат 2. изопентилпирофосфат 3. фарнезилпирофосфат 4. сквален 5. ланостерин 44. Вторичные посредники в передаче гормонального сигнала 1. ДАГ 2. инозитол-1,4,5-трифосфат 3. ц-АМФ 4. адреналин 5. биотин 45. Остаточные хиломикроны (ХМ) – это 1. ХМ, лишившиеся белка 2. ХМ, лишившиеся холестерина 3. ХМ, лишившиеся ТАГ 4. ХМ, разрушающиеся в печени 46. Синтез высших жирных кислот протекает в 1. ядре 2. рибосомах 3. лизосомах 4. цитоплазме 5. комплексе Гольджи 47. Удлиннение цепи высших жирных кислот (С18, C20 …) может происходить в 1. ядре 2. митохондриях 3. лизосомах 4. плазматической мембране 5. рибосомах 48. В синтезе фосфоглицеролипидов принимают участие 1. 1,2-диацилглицеролы 2. фосфатидная кислота 3. сфингозин 4. цитидинтрифосфат 5. желчные кислоты 49. Транспорт холестерина из периферических тканей в печень осуществляют 1. ЛПВП 2. ЛПНП 3. ЛПОНП 4. желчные кислоты 50. Простагландины синтезируются у человека из кислоты 1. олеиновой 2. пальмитиновой 3. стеариновой 4. арахидоновой 5. арахиновой 51. Восстановленный НАДФ(Н+) для биосинтеза ВЖК и холестерина поставляется в основном за счет 1. гликолиза 2. цикла Кребса 3. b-окисления ВЖК 4. дезаминирования аминокислот 5. пентозофосфатного пути окисления глюкозы 52. Возможно ли превращение ацетил-КоА в глицерин в организме животных? 1. наукой не установлено 2. возможно 3. невозможно 53. Из холестерина в организме человека не могут образоваться 1. андрогены 2. желчные кислоты 3. желчные пигменты 4. кортикостероиды 5. прогестерон 6. катехоламины 54. Энтерокиназа обнаружена в 1. слюне 2. желудке 3. кишечнике 4. мышцах 5. печени 55. Может ли печень использовать ацетоновые тела для получения ацетил-КоА? 1. может 2. не может 3. наукой не установлено 56. Может ли свободный глицерин использоваться в жировой ткани для синтеза ТАГ? 1. может 2. не может 3. наукой не установлено

Правильные ответы

1.1 2.5 3.1 4.1, 2, 4 5.2, 5 6.3, 4, 5 7.5 8.2 9.1, 2, 5 10.1, 5 11.1, 3 12.3, 4, 5 13.1 14.5

15.1, 3, 4 16.1, 2, 3, 4 17.2, 3, 4, 5 18.1, 2 19.4 20.3, 4 21.1 22.2, 4, 5 23.3 24.3 25.3 26.1 27.3, 5 28.4

29.4 30.3 31.3, 5 32.3, 4 33.3, 5 34.1, 2, 3 35.2 36.3 37.1, 2 38.2 39.1, 5 40.3 41.1 42.2

43.5 44.1, 2, 3 45.3 46.4 47.2 48.1, 2, 4 49.1 50.4 51.5 52.3 53.3, 6 54.3 55.2 56.2

Раздел 6: Переваривание белков и обмен аминокислот

Введение

Белковому обмену принадлежит особое место среди других видов обмена веществ. Это объясняется выполнением белками специфических функций, которые не могут заменить ни углеводы, ни липиды: пластической, каталитической, иммунной.

В организме человека ежесуточно распадается до аминокислот (АМК) около 400 г белков и столько же синтезируется. Основным источником АМК для человека являются пищевые белки. Суточная норма потребления белков составляет около 100 г. Все 20 АМК, которые входят в состав белков организма, можно разделить на заменимые (синтезируемые самим организмом) и незаменимые (не синтезируются и должны поступать с пищей). Присутствие в пищевых белках всех незаменимых АМК определяет полноценность белкового питания человека.

Поскольку белки всех организмов отличаются строгой видовой и тканевой специфичностью, организм человека использует белки пищи только после их полного гидролиза до АМК в желудочно-кишечном тракте под действием ряда протеолитических ферментов – петидаз. Все пептидазы в зависимости от места расположения гидролизуемой пептидной связи подразделяются на:

1) эндопептидазы, гидролизующие пептидные связи, удалённые от концов пептидной цепи: пепсин, трипсин, химотрипсин, эластаза.

2) экзопептидазы, гидролизующие пептидые связи, образованные N- и C-концевыми аминокислотами: аминопептидаза, карбоксипептидаза, дипептидаза.

Желудочные и панкреатические пептидазы вырабатываются в неактивной форме, секретируются в месте действия, где активируются путём частичного протеолиза. Такой механизм образования активных ферментов необходим для защиты секреторных клеток желудка и поджелудочной железы от самопереваривания.

Переваривание белков в желудке происходит под действием пепсина. Профермент пепсиноген вырабатывается главными клетками слизистой желудка и при поступлении пищи секретируется в полость желудка. Пепсиноген активируется двумя способами:

1) соляной кислотой (медленно);

2) аутокаталитически (быстро) уже имеющимся пепсином.

Желудочный сок содержит соляную кислоту, которая вырабатывается обкладочными клетками желудка и выполняет следующие функции:

1) оказывает бактерицидное действие;

2) денатурирует белки пищи;

3) создаёт оптимум рН для пепсина;

4) активирует пепсиноген путём частичного протеолиза.

Переваривание белков в кишечнике происходит под действием:

1) ферментов поджелудочной железы: трипсина, химотрипсина, эластазы, карбоксипептидаз;

2) ферментов тонкой кишки: аминопептидаз, дипептидаз, трипептидаз.

Активная форма трипсина образуется в кишечнике при участии энтеропептидазы, которая отщепляет от N-конца трипсиногена гексапептид, что приводит к изменению конформации молекулы и формированию активного центра трипсина.

Остальные протеазы панкреатического сока: химотрипсиноген, прокарбоксипептидаза, проэластаза – активируются трипсином.

Активация панкреатических пептидаз происходит по каскадному механизму. Кишечные пептидазы синтезируются в энтероцитах сразу в активной форме.

Конечным результатом переваривания белков является образование свободных АМК, поступающих в клетки слизистой оболочки кишечника путём активного транспорта.

Большая часть свободных АМК, образующихся в результате переваривания белков, используется для синтеза собственных белков организма, часть на синтез биологически активных молекул: гормонов, биогенных аминов, а также нуклеотидов, гема, креатинфосфата и многих других соединений, в том числе глюкозы в процессе глюконеогенеза.

Важнейший путь превращения АМК в организме – это реакции трансаминирования с α-кетокислотами с образованием новых (заменимых) АМК.

Ещё один путь метаболизма – декарбоксилирование АМК с образованием биологически активных молекул – биогенных аминов. Основным коферментом обмена АМК является пиридоксальфосфат (ПФ).

Деградация АМК происходит путём их дезаминирования: безазотистые остатки могут использоваться для синтеза глюкозы (глюконеогенез) или, превращаясь в ацетил-КоА, окисляться до углекислого газа и воды с образованием энергии (различают гликогенные и кетогенные АМК).

В данном разделе приводится лабораторная работа по количественному анализу кислотности желудочного сока, позволяющая оценить содержание свободной, связанной, общей соляной кислоты, а также общей кислотности желудочного сока.

Процесс трансаминирования представлен двумя работами:

1) количественное определение аспартатаминотрансферазы (АсАт) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови, имеющее диагностическое значение при поражениях сердца и для дифференциальной диагностики болезней печени;

2) хроматографическое доказательство активности АлАТ.

Ранней диагностике наследственного заболевания – фенилпировиноградной олигофрении (фенилкетонурии) – посвящена работа по количественному определению фенилаланина в сыворотке крови.

Количественное определение конечных продуктов обмена белков представлено двумя лабораторными работами:

1) количественное опеделение мочевины в моче ферментативным (уреазным) методом;

2) колориметрический метод количественного определения креатинина в моче.