Методы изучения ферментативной активности бактерий
Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.
Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).
Каталаза – фермент, расщепляющий Н2О2 с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н2О2.
Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.
Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки - протеолитическими свойствами.
Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО2 или Н2 ), а при распаде белков - образование щелочей, H2S, NH3.
Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.
Изучение сахаролитических свойств.
Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева,а такжежидкие и полужидкие среды Гисса.
Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор.
Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.
Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.
Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.
Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.
Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.
Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается "пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".
Изучение протеолитических свойств.
Протеолитические свойства бактерий изучают:
а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент - коллагеназа;
б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н2S, NH3.
Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н2S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH3 – лакмусовая бумажка (синий цвет).
Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.
ЛЕКЦИЯ № 6
Культивирование бактерий и вирусов.
Культивирование – искусственное выращивание микроорганизмов. Используется для изучения свойств микроорганизмов и для диагностики инфекционных заболеваний.
Культивирование бактерий.
Для культивирования необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О2) или создание бескислородных условий для анаэробов; 4) определенной время для выращивания (чаще – 24 час).
Требования к питательным средам.
а) среды должны быть питательными - содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества;
б) иметь определенное значение рН; для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4;
в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды;
г) быть изотоничными - осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки;
д) быть стерильными для получения чистой культуры;
е) содержать достаточное количество Н2О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии;
ж) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, для аэробов rH2 – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;
з) быть прозрачными;
Классификация питательных сред.
По консистенции среды делят на:
а) жидкие: пептонная вода (ПВ), мясопептонный бульон (МПБ);
б) полужидкие: полужидкий мясопептонный агар (МПА) и др.;
в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка;
г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок;
д) сухие – гигроскопические порошки, выпускаемые промышленностью;
Для уплотнения сред используют агар, желатин или селикагель. Агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он образует в воде гели, которые плавятся при температуре 100° С и застывают при 45° С. К полужидким средам агар добавляют в количестве 0,5% (0,3-0,7%), к плотным – 1,5-2%.
По составу среды делят на:
а) естественные – натуральные продукты (яйца, овощи), животные ткани, желчь, сыворотка крови;
б) искусственные – среды, приготовленные из различных настоев или отваров с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ;
в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях.
По назначению среды делят на:
а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; простые среды служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;
б) специальные (сложные) - используют для тех микроорганизмов, которые не растут на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ и МПА, кровяной МПА, асцитический МПБ;
в) элективные (избирательные) – используют для определенных видов; создаются оптимальные условия для этих видов, а другие виды не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза);
г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается так, чтобы выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.
Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.
Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.
Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов).
Эти среды используются для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae. Они позволяют отличить патогенные микроорганизмы от кишечной палочки (см. лекцию №5)..
Среды Гисса служат для изучения сахаролитических свойствах микробов (см. лекцию №5