Методическая часть лабораторной работы.

Таким образом, целью данного практического занятия является ознакомление с методикой анализа белков при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (возможные варианты сокращений, наиболее часто встречающихся в литературе:ДСН‑ПААГ, SDS‑ПААГ, SDS‑PAGE).

Для реализации поставленной цели необходимо:

- приготовить полиакриламидный гель, применимый для разделения белков с соответствующей молекулярной массой;

- приготовить образцы для электрофореза;

- приготовить электродный буферный раствор;

- провести электрофоретическое разделение исследуемых образцов;

- окрасить гель при помощи раствора кумасси ярко-синего

- получить электрофореграмму и проанализировать полученные результаты.

Техника безопасности

Лабораторное занятие проводится при строгом соблюдении правил безопасности при работе в химической лаборатории и эксплуатации электроприборов.

Расходные материалы и оборудование

1. Камера для вертикального электрофореза белков «MiniProteanTetra» (Bio-Rad, США или аналог);

2. Источник тока «Эльф-8» (ДНК-технология, Россия или аналог);

3. Система гель-документирования с функцией детекции в видимой области светового излучения (UVP, США или аналог) – не обязательное оборудование;

4. Электронные аналитические весы (Shimadzu, Япония или аналог) и набор шпателей для взвешивания;

5. Система для получения деионизированной воды milliQ (Millipore, США или аналог);

6. Термостат «Гном» (ДНК-технология, Россия или аналог);

7. Комплект оборудования для формирования геля (Bio-Rad, США или аналог);

8. Настольная центрифуга (Eppendorf, Германия или аналог);

9. рН-метр (Аквилон, Россия или аналог);

10. Холодильник (Стинол, Россия или аналог);

11. Шейкер (ELMI, Латвия или аналог);

12. Набор автоматических пипеток (Sartorius, Швейцария или аналог);

13. Магнитная мешалка с нагревом (HeidolphInstruments, Германия или аналог);

14. Набором магнитов для мешалки (HeidolphInstruments, Германия или аналог);

15. Химические стаканы (Simax, Чехия или аналог);

16. Пластиковые пробирки на 1.5, 5 и 50 мл (Corning или аналог);

17. Мерные колбы на 50, 100 и 1000мл (Simax, Чехия или аналог);

18. Мерные цилиндры (50 и 100мл) и мерные стеклянные стаканы (Simax, Чехия или аналог);

19. Стеклянные бутыли для хранения растворов (Simax, Чехия или аналог);

20. ; Фильтровальная бумага, парафильм;

21. Носики для автоматических пипеток (Corning или аналог)

22. Носики для автоматической пипетки для нанесения образцов в гель (Corning или аналог), либо шприц многоразовый на 25 мкл (Hamilton, Швейцария или аналог)

2.2 Реактивы:

акриламид, N,N' –метиленбисакриламид, Трис, додецилсульфат натрия (SDS), персульфат аммония, N,N,N',N' – тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), глицин, глицерин, β-меркаптоэтанол, ЭДТА, бромфеноловый синий, кумассиR250 (Bio-Rad, США или аналог), набор маркеров молекулярных масс белков (15-150 кДа) (ThermoScientific или аналог), уксусная кислота, соляная кислота (х.ч), этанол.

2.3. Прописи для приготовления требуемых растворов:

1%-ный раствор бромфеноловогосинего

Способ приготовления: Навеску бромфенолового синего растворить в воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Хранить при комнатной температуре.

Лабораторная пропись для получения 10 мл раствора: 0.1г бромфенолового синего, деионизированная вода.

30%-ный раствор бис-акриламида

Состав:1% BIS, 29% акриламид, деионизированная вода.

Способ приготовления: Соответствующие навески веществ растворить в воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Добавить активированный уголь и оставить для перемешивания на ночь на магнитной мешалке. Профильтровать и хранить при 4 ⁰С.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 1г BIS, 29г акриламида, деионизированная вода.

10%-ный раствор персульфата аммония

Состав: персульфат аммония, деионизированная вода.

Способ приготовления: Навеску персульфата аммония растворить в деионизированной воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Хранить при ‑20⁰С.

Лабораторная пропись для получения 5 мл раствора:0.5г персульфата аммония, деионизированная вода.

10%-ная уксусная кислота

Состав: «ледяная» уксусная кислота, деионизированная вода.

Способ приготовления: Разбавить «ледяную» уксусную кислоту водой MilliQ в соотношении 1:9. Хранить при комнатной температуре.

Лабораторная пропись для получения 100мл раствора: 10мл «ледяной» уксусной кислоты, 90 мл деионизированной воды.

М раствор ЭДТА, рН 8.0

Состав: Na₂ЭДТА×2H₂O, NaOH, деионизированная вода MilliQ.

Способ приготовления: К 186.1 грамму Na₂ЭДТА×2H₂Oдобавить 350 мл MilliQ. Подвести рН до 8.0 при помощи 10 Мраствора NaOH (примерно 25 мл). Довести объем раствора до 500 мл деионизированной водой MilliQ.