Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)
Явление ЭПР состоит в резонансном поглощении энергии электромагнитного поля парамагнитным веществом, помещенным в постоянное магнитное поле. Однако не все электроны могут быть исследованы при помощи метода ЭПР. Большинство химических соединений состоит из атомов с заполненными электронными оболочками, в которых все электроны спарены вследствие антипараллельной связи между ними. В соответствии с принципом Паули в результате попарного взаимодействия электронов их собственные спиновые магнитные моменты взаимно скомпенсированы, а суммарный магнитный момент равен нулю.
ЭПР-поглощение определяется магнитными свойствами вещества, т. е. магнитными свойствами электронов и ядер атомов..
Электрон обладает и собственным механическим вращением – спином и связанным с ним магнитным моментом. Условием возникновения ЭПР является наличие у частиц исследуемого образца некомпенсированных магнитных моментов, обусловленных спином неспаренных электронов. В системах с нечетным числом неспаренных электронов каждый электронный уровень вырожден по спину, по крайней мере дважды, т. е. уровни, характеризующиеся положительным и отрицательным значением магнитного квантового числа электрона m.s (например +1/2 и – 1/2), не отличаются по энергии.
В отсутствие внешнего магнитного поля все электроны парамагнитного вещества имеют произвольную ориентацию спина и обладают одинаковыми энергиями, т. е. наблюдается вырождение энергетического уровня (рис. 41, а). При помещении образца, обладающего парамагнетизмом, в постоянное магнитное поле вырождение снимается, т. е. появляются энергетические уровни, связанные с разрешенными ориентациями элементарных магнитных моментов электронов (рис. 41, б). Промежуточные ориентации спинов относительно магнитного поля запрещены условиями квантования.
Рис. 11. Схема расщепления энергетических уровней неспаренных электронов при наложении внешнего магнитного поля при отсутствии сверхтонкого взаимодействия.
При наложении внешнего магнитного поля электронные уровни расщепляются на два подуровня в соответствии со значением спиновых чисел +½ и – ½ с разницей в энергии
DE=gbH,
где H – напряженность магнитного поля; b– магнетон Бора, равный 9,274 • 10-24 Дж • Тл-1.
На рис. 11 представлена схема расщепления энергетических уровней неспаренных электронов (спиновое квантовое число системы s = ½) при наложении внешнего магнитного поля. При этом энергия частиц, спины которых ориентированы по полю, на ½ gbH меньше энергии частиц в отсутствие внешнего магнитного поля. Энергия частиц, спины которых ориентированы против поля на 1/2 gbH, превышает значение в нулевом поле. Следовательно, разность энергий уровней равна gbH. Электроны в подсистемах Е1 и Е2 возникших во внешнем магнитном поле, почти равномерно распределяются по двум уровням энергии с незначительным преобладанием электронов со спином, ориентированным по полю.
Между двумя уровнями возможны энергетические переходы, в результате которых ориентация спинов будет изменяться на противоположную. Согласно принципам квантовой механики, переходы между энергетическими состояниями могут быть вызваны поглощением кванта hv. Если на спиновую систему, находящуюся в постоянном магнитном поле, воздействовать переменным сверхвысокочастотным электромагнитным полем с частотой v и энергией квантов hv, то при условии резонанса
hv = DЕ = gbH
индуцируются переходы между указанными энергетическими уровнями, т. е. происходит обращение спинов. При переходе с нижнего Е1 уровня на верхний Е2 происходит поглощение энергии электромагнитного поля; одновременно с такой же вероятностью осуществляются переходы с уровня Е2 на уровень Е1 с испусканием энергии. Как правило, поглощение превышает индуцированную эмиссию. Общее число неспаренных электронов в системе и разница в заселенности электронами двух энергетических уровней определяют интенсивность наблюдаемого сигнала ЭПР.
Измерение спектра ЭПР вследствие резонансных переходов электронов можно проводить двумя способами: 1) изменять напряженность магнитного поля Н при фиксированном значении частоты v; 2) изменять v при фиксированном значении Н. На практике ЭПР-спектрометры работают на фиксированной частоте v излучения при измененииН.
Как и ЯМР-спектрометр,ЭПР-спектрометрсостоит из электромагнита, источника СВЧ-излучения и электронной системы регистрации сигнала. Но поскольку ядерный магнетон более чем на три порядка меньше магнетона Бора, то при данной напряженности магнитного поля Н резонансная частота v для неспаренного электрона обычно в 103 раз превышает частоту, на которой работают ЯМР-спектрометры. Если эксперименты по ЯМР проводятся на частотах в диапазоне мегагерц (106 Гц), то ЭПР-спектрометры работают в диапазоне гигагерц (109 Гц).
Основными параметрами сигнала ЭПР являются фактор спектроскопического расщепления (g-фактор), интенсивность (количество неспаренных электронов в образце), ширина и форма линии.
Фактор спектроскопического расщепления характеризует положение линии в спектре ЭПР, определяемое тем, насколько свойства неспаренных электронов, ответственные за поглощение энергии в данном веществе, близки к свойствам свободного электрона, магнетизм которого обусловлен только спином, а g-фактор равен 2,0023. Для большинства парамагнитных центров g-фактор отличается от значения 2,0023 в сторону, как уменьшения, так и увеличения.
Например, сигналы ЭПР, обусловленные низкоспиновым состоянием гемового железа цитохрома Р-450 имеют g1 = 2,42, g2 = 2,25 и g3 =1,91. Восстановление этой молекулы переводит атом железа высокоспиновую форму со значениями g1 = 6,1 и g2 = 2,0 в спектре ЭПР.
Для парамагнитных центров, содержащих магнитные ядра, в спектре ЭПР возможно наблюдение сверхтонкой структуры (СТС), которая возникает в результате взаимодействия неспаренных электронов с магнитными моментами ядер. Аналогично электронным спинам, ядерные магнитные моменты, ориентируются в магнитном поле дискретно (либо вдоль внешнего магнитного поля, либо против него). Ядра многих атомов обладают спином и, следовательно, собственным магнитным моментом, который по абсолютной величине на три порядка меньше магнитного момента электрона. Количество компонентов сверхтонкой структуры определяется значениями ядерного спина данного атома по формуле 2I + 1, где I– значение ядерного спина атома. Следовательно, взаимодействие электрона с ядром приводит к расщеплению каждого электронного уровня энергии на 2I+ 1 уровней. Вследствие этого резонансное поглощение также расщепляется на 2I+ 1 равноудаленных линий одинаковой интенсивности.
С помощью метода ЭПР показано, что биологические системы животного и растительного происхождения содержат свободные радикалы, которые представляют собой молекулу или ее компоненты, имеющие неспаренный электрон. Свободные радикалы обладают парамагнитными свойствами благодаря и ее компенсированным магнитным моментам неспаренных электронов.
Метод ЭПР нашел эффективное применение для изучения молекулярных переносчиков электроннотранспортной цепи мембран митохондрий, включающих НАДН, флавины, кофермент Q10, железосерные центры, цитохромы в, с1,c, а также цитохром с-оксидазу. В митохондриях различных органов при низких температурах ( -200 С) регистрируется сигнал ЭПР с g-фактором 1,94, который обусловлен комплексами негемового железа в восстановленной форме.
ЭПР, ЯМР-спектроскопия получила дальнейшее свое развитие вследствие применения спиновых меток, синтезированных соединений, содержащих парамагнитный центр. При исследовании биологических молекул методом ЭПР в качестве спиновых меток широко используются нитроксильные радикалы (N'–О), содержащие неспаренные электроны. Спиновые метки ковалентно связываются с какой либо атомной группой в исследуемой молекуле. Если парамагнитный радикал связывается с биологической молекулой электростатическими силами или гидрофобными взаимодействиями, то такой радикал называется спиновым зондом. В ЯМР-спектроскопии в качестве спиновых меток и зондов используются бромацетамид, N- (тетраметилпирролидинил)-мальимид.
Интерпретация интенсивности, ширины и формы линий спектра ЭПР спиновой метки, введенной в биологическую структуру, дает информацию о физических и физико-химических параметрах микроокружения введенного радикала.. Определение спектра ЯМР позволяет судить о фазовых переходах в липидном бислое мембраны и других средах. Так, параметр упорядоченности для липидов в жидком состоянии в несколько раз выше, чем в твердом состоянии. Снижение вязкости мембран приводит к уменьшению значения этого параметра.
Благодаря применению спиновых меток и зондов получены новые данные о строении и функционировании субклеточных структур, о липидах и белках, о липид-белковых взаимодействиях в мембранах.
Примеры использования ЯМР и ЭПР –спектроскопии:
1. Состояние молекул белков и липидов при фазовых переходах липидов мембран, белок-липидные взаимодействия
2. исследование свойств активных центров ферментов, роли кофактора в ферментно-субстратном связывании
3. Изменение структуры т-РНК при спаривании оснований
4. Измерение расстояния между атомными группировками, содержащие различные свободные радикалы
Вопросы и задания для самоконтроля:
1. Опишите процесс поглощения света молекулами.
2. 2. Какую молекулу называют хромофором? Приведите примеры биологических хромофоров ( в составе клеток).
3. 3. Сформулируйте закон Ламберта –Бэра. При каких условиях этот закон не соблюдается?
4. 4. Объясните принцип работы спектрофотометра. Какие типы спектрофотометров Вы знаете?
5. 5. Для каких целей используются спектрофотометры в биологических исследованиях?
6. 6. Дайте объяснения терминам: спектр поглощения, спектр возбуждения, спектр флоуресценции.
7. 7. Опишите принцип работы ЯМР- ЭПР –спектрометра.. Для каких целей используются эти приборы в биологии?
8. 8. Опишите схематично работу ДОВ-спектропляриметра и КД-дихрографа.
9. 9*. Будет ли протонный спектр смеси фенилаланина и глицина суммой спектров каждой из них? Изменится ли протонный спектр смеси аминокислот при повышении их концентраций?
10. 10*. Вам нужно определить содержание цитохрома с в одной клетке E. сoli. Известен молярный коэффициент поглощения ε этого фермента при λ280. Как Вы проделаете это измерение?
11. 11*. Структура белковой молекулы была определена путем рентгеноструктурного анализа кристаллов белка. Найдено, что молекула содержит 30 % α-спирали, 58 % β- спирали, 12 % беспорядочного клубка. По данным КД раствора белка, содержание α-спирали составляет 60 %, β- спирали – 35 %, неупорядоченные участки – 5 %. Какое заключение о структуре молекулы этого белка Вы можете сделать?
12. 12*. Спектры ДОВ и КД различных видов фагов существенно отличаются друг от друга и от спектров свободной ДНК. Какой вывод можно сделать о структуре ДНК в этих клетках?
13.