Окисление моносахаридов в кислоты

У некоторых бактерий, фотосинтезирующих морских водорослей, грибов и в клетках животных найдены ферменты, катализирующие окисление свободных моносахаридов, которые не подвергаются активированию путем фосфорилирования. Из клеток плесневых грибов выделен фермент глюкозооксидаза, способный превращать D-глюкозу в глюконовую кислоту. Этот фермент действует на b-пиранозную форму глюкозы, которая образуется из a-формы под действием фермента мутаротазы. В результате действия глюкозооксидазы образуется лактон глюконовой кислоты и пероксид водорода. Затем лактон глюконовой кислоты неферментативным путём подвергается гидролизу, превращаясь в глюконовую кислоту, а пероксид водорода разлагается каталазой на кислород и воду:

Н ОН Н О Н О \ / \ / // СООН С------ С------- глюкозо- С------ | | | | | оксидаза | | Н–С–ОН Н–С–ОН | мутаро- Н–С–ОН | +О2 Н–С–ОН | +Н2О | | О ¾¾® | О ¾¾® | О ¾® НО–С–Н НО–С–Н | таза НО–С–Н | НО–С–Н | | | | | | Н2О2 | | Н–С–ОН Н–С–ОН | Н–С–ОН | Н–С–ОН | | | | | | | | Н–С–ОН Н–С------- Н–С------- Н–С------ | | | | СН2ОН СН2ОН СН2ОН СН2ОН a-D-глюкоза b-D-глюкоза лактон глю- глюконовая коновой кислоты кислота

Фермент глюкозооксидаза представляет собой глюкопротеид, содержащий в активном центре ФАД. Этот фермент действует только на D-глюкозу. Однако в клетках некоторых бактерий найден другой фермент гексозооксидаза, который катализирует превращение в альдоновые кислоты наряду с глюкозой и других гексоз.

СООН СООН СООН | | | Н–С–ОН фосфоглюконат- С–ОН С=О | дегидратаза || | НО–С–Н ¾¾¾® С–Н ¾¾® Н–С–Н | | | Н–С–ОН Н2О Н–С–ОН Н–С–ОН | | | Н–С–ОН Н–С–ОН Н–С–ОН | | | СН2О Р СН2О Р СН2О Р 6-фосфоглюконо- енольное производное 2-кето-3-дезокси-6-фосфо- вая кислота 6-фосфоглюконовой кислоты глюконовая кислота

Образовавшаяся при окислении глюкозы глюконовая кислота далее фосфорилируется под действием фосфоглюконаткиназы и превращается в 6-фосфоглюконовую кислоту, которая может включаться в пентозофосфат-ный цикл или подвергаться дегидратации. При этом молекула воды отщепляется от a,b-углеродных атомов с образованием a,b-ненасыщенного енола, который самопроизвольно переходит в более устойчивую кетоформу 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовую кислоту. Эту реакцию катализирует фермент фосфоглюконатдегидратаза:

Далее 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовая кислота расщепляется

Далее 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовая кислота расщепляется

СООН СООН Н О | | \ // С=О С=О С | альдолаза | | Н–С–Н ¾¾¾® СН3 + Н–С–ОН | пировиноградная | Н–С–ОН кислота СН2О Р | 3-фосфоглицери- Н–С–ОН новый альдегид | СН2О Р 2-кето-3-дезокси-6- фосфоглюконовая кислота

альдолазой на пировиноградную кислоту и трифосфоглицериновый альдегид:

Продукты этой реакции 3-фосфоглицериновый альдегид и пировиноградная кислота могут далее окисляться в реакциях дыхания, включаясь в них на стадии гликолиза (3-фосфоглицериновый альдегид) или цикла Кребса (пировиноградная кислота). 3-Фосфоглицериновый альдегид, кро-ме того, может подвергаться превращениям в пентозофосфатном цикле. Реакции превращения 6-фосфоглюконовой кислоты в пировиноградную кислоту и 3-фосфоглицериновый альдегид называют путем Энтнера Н. и Дудорова М. по имени исследователей, впервые изучивших такие реакции у бактерий.

Анаэробное дыхание

У анаэробных организмов обеспечение энергией процессов жизнедеятельности осуществляется в отсутствии кислорода и такой путь окисления органических веществ получил название брожения. Впервые на это обратил внимание Л. Пастер, изучавший процессы образования этилового спирта (1860 г.) клетками дрожжей в анаэробных условиях. Более детально биохимический механизм брожения сахара под действием дрожжей был выяснен в 1897 г. Э. Бухнером, который показал, что в дрожжевом экстракте содержатся ферменты, катализирующие реакции превращения сахара в этиловый спирт.

В дальнейшем было показано, брожение происходит не только у дрожжей, но и у многих видов бактерий, трихомонад, некоторых форм беспозвоночных, а также в некоторых органах и тканях растений, животных и человека. Согласно современным теориям о происхождении жизни на Земле брожение является более древней формой получения живыми клетками энергии, чем аэробное дыхание, так как на ранних этапах зарождения жизни кислорода в атмосфере Земли не было.

Для большинства видов брожения важнейшим промежуточным продуктом является пировиноградная кислота, которая образуется в реакциях гликолиза. В зависимости от вида брожения пировиноградная кислота подвергается соответствующим превращениям.

Спиртовое брожение. При спиртовом брожении пировиноградная кислота декарбоксилируется с участием фермента пируваткарбоксилазы и превращается в уксусный альдегид, который затем восстанавливается до спирта алкогольдегидрогеназой:

СН3 пируватдекар- СН3 алкогольде- | боксилаза | гидрогеназа С=О ¾¾¾¾® С ¾¾¾¾¾¾® СН3-СН2ОН | / \\ этиловый спирт СООН СО2 Н О НАД Н+Н⁺ пировиноград- уксусный НАД+ ная кислота альдегид

Пируваткарбоксилаза представляет собой димерный белок с молекулярной массой 200 тыс., в составе каталитического центра он содержит в качестве кофермента тиаминпирофосфат и катионы Мg²⁺.

У алкогольдегидрогеназы роль кофермента выполняют динуклеотиды НАД, которые связываются с такой же пептидной группировкой, как и в глицеральдегидфосфатдегидрогеназе (стр. 93-94). В каталитическом центре алкогольдегидрогеназы активную функцию в переносе водорода выполняют катионы Zn²⁺.

Спиртовое брожение осуществляют в процессе своей жизнедеятельности клетки дрожжей, относящихся к роду Saccharomyces, плесневых грибов (Mucor, Fusarium), а также некоторых других микроорганизмов (Monilia, Oidium).

Субстраты спиртового брожения – гексозы, а также сахароза, мальтоза, лактоза, крахмал после его превращения в гексозы. На основе спиртового брожения разработаны бродильные технологии получения этилового спирта, вина и пива. Кроме спирта в процессе брожения в некотором количестве синтезируются побочные продукты – янтарная кислота, амиловый, бутиловый и изоамиловый спирты (сивушные масла), уксусный альдегид, глицерин. У некоторых бактерий в качестве продуктов брожения образуются этиловый спирт, уксусная кислота, СО₂ и Н₂ (E. сoli).

Спиртовое брожение наряду с аэробным дыханием может происходить в растительных клетках при недостатке кислорода. Так, на ранних этапах прорастания семян, когда они находятся ещё на стадии набухания, в тканях семян очень сильно понижается концентрация кислорода, вследствие чего инициируется процесс образования этилового спирта. Аналогичная ситуация наблюдается в созревающих плодах и овощах, когда в их тканях увеличивается содержание СО₂, а количество кислорода снижается до 1-2 %. При созревании плодов и овощей наблюдается не только накопление спирта, но и уксусного альдегида, который является предшественником при образовании этилового спирта.

СООН СООН | | С=О + НАД×Н + Н+ ¾¾® Н–С–ОН + НАД+ | | СН3 СН3 пировиноград- молочная ная кислота кислота

Молочнокислое брожение. В ходе молочнокислого брожения также осуществляются реакции гликолиза, образующие пировиноградную кислоту. Затем пировиноградная кислота восстанавливается лактатдегидрогеназой до молочной кислоты. Роль кофермента выполняет восстановленный НАД×Н, который является продуктом гликолиза:

Лактатдегидрогеназа – тетрамерный белок с молекулярной массой около 140 тыс. В активном центре этого фермента локализованы аминокислотные радикалы гистидина, аргинина, тирозина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, причём наиболее активную роль в переносе водорода от НАД×Н на молекулу пировиноградной кислоты играет остаток гистидина.

Если в ходе молочнокислого брожения в основном образуется молочная кислота, а выход побочных продуктов небольшой, то такой тип брожения называют гомоферментативным. Гомоферментативное молочнокислое брожение осуществляют Streptoceus lactis, Termobacterium cereale, Lactobacillus casei. Известны другие формы молочнокислых бактерий, которые при брожении образуют, кроме молочной кислоты, уксусную кислоту и этиловый спирт, СО₂, Н₂, СН₄ и некоторые другие продукты. Такой тип молочнокислого брожения называют гетероферментативным.

У некоторых молочнокислых бактерий (род Lactobacillus, Leuconostoс mesenteroides) гетероферментативное окисление глюкозы в лактат осуществляется через фосфоглюконатный путь. Как и в пентозофосфатном цикле, глюкоза фосфорилируется и окисляется до 6-фосфо-глюконовой кислоты, которая, подвергаясь декарбоксилированию, превращается в рибулозо-5-фосфат. После этого рибулозо-5-фосфат под действием фермента фосфокетолазы расщепляется на два продукта 3-фосфо-глицериновый альдегид и ацетилфосфат. Затем 3-фосфоглицериновый альдегид окисляется в пировиноградную кислоту, как и в реакциях гликолиза, а последняя восстанавливается в молочную кислоту. А из ацетилфосфата образуется этанол.

На основе молочнокислого брожения разработаны промышленные технологии получения целого ряда пищевых продуктов и кормов: производство кефира, простокваши и других кисломолочных продуктов; приготовление кваса и дрожжей для хлебопечения, квашение овощей, силосование кормов. В процессе приготовления многих из этих продуктов наряду с молочнокислым осуществляется также спиртовое брожение (в квасе, кефире, хлебопекарных дрожжах и др.)

Молочнокислое брожение довольно активно проходит в некоторых тканях животных, рыбы, птиц, человека. Так, например, в белых мышцах домашних птиц продукты аэробного дыхания почти не накапливаются, в то же время образуется довольно много молочной кислоты. В хрусталике и роговице глаз человека основным источником энергии является анаэробное дыхание, конечным продуктом которого является молочная кислота. Продукты молочнокислого брожения найдены также в проростках растений, а также при хранении в клубнях картофеля, корнеплодах, яблоках, некоторых овощах.

Маслянокислое брожение. Сбраживание гексоз и других углеводов, способных превращаться в гексозы, в масляную (бутановую) кислоту осуществляют в основном анаэробные микроорганизмы, типичными примерами которых являются обитающие в почве бактерии рода Clostridium и бактерии пищеварительного тракта животных Eubacterium и Butyrivibrio. У них в процессе сбраживания глюкозы осуществляются реакции гликолиза и окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты с образованием ацетил-КоА. У этих микроорганизмов часть восстановленных динуклеотидов НАД×Н, образуемых в реакциях гликолиза и окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты, реокисляются с образованием молекулярного водорода. Эту реакцию катализирует фермент гидрогеназа, представляющий собой железо-серный белок:

гидрогеназа

НАД×Н + Н⁺ ¾¾¾¾® НАД⁺ + Н₂

Полученный в выше указанных реакциях ацетил-КоА далее подвергается конденсации под действием ацетоацетил-КоА-тиолазы с образованием ацетоацетил-КоА:

СН₃–С~S–КоА + СН₃–С~S–КоА ¾® СН₃–С–СН₂–С~S–КоА + НS–КоА

|| || || ||

О О О О

ацетоацетил-КоА

Затем ацетоацетил-КоА восстанавливается ацетоацетил-КоА-дегидро-геназой в 3-оксибутирил-КоА:

СН₃–С–СН₂–С~S–КоА+НАД×Н+ Н⁺¾®СН₃–СН–СН₂–С~S–КоА +НАД⁺

|| || | ||

О О ОН О

ацетоацетил-КоА 3-оксибутирил-КоА

З-Оксибутирил-КоА далее подвергается дегидратации под действием фермента еноилгидратазы и превращается в кротонил-КоА, который восстанавливается дегидрогеназой в бутирил-КоА:

СН₃–СН–СН₂–С~S–КоА¾®СН₃–СН=СН–С~S–КоА ¾® СН₃-СН₂-СН₂-С~ S-КоА

| || || НАД×Н+Н⁺ ||

ОН О Н₂О О НАД⁺ О

3-оксибутирил-КоА кротонил-КоА бутирил-КоА

В последней реакции маслянокислого брожения энергия макроэргической связи бутирил-КоА используется для синтеза АТФ в ходе реакции фосфоролиза, которая осуществляется по такому же механизму, как и фосфоролиз сукцинил-КоА (стр. 383-384). В ходе реакции фосфоролиза бутирил-КоА превращается в масляную кислоту, а КоА высвобождается:

СН₃–СН₂–СН₂–С~S–КоА + Н₃РО₄ + АДФ¾®СН₃–СН₂–СН₂–СООН + НS–КоА + АТФ

||

О

бутирил-КоА масляная кислота

Кроме масляной кислоты при маслянокислом брожении образуются также уксусная кислота, СО₂ и водород, а при некоторых модификациях брожения в качестве побочных продуктов также могут образовываться бутанол и изопропанол. Маслянокислое брожение очень активно происходит в среде, где ограничен доступ кислорода: в заболоченных почвах и на дне болот, в преджелудках жвачных животных, в илистых отложениях.

Пропионовокислое брожение. Субстратами пропионовокислого брожения являются глюкоза и молочная кислота, которые в ходе уже известных реакций превращаются в пировиноградную кислоту. В дальнейшем пировиноградная кислота карбоксилируется с участием карбоксилтрансферазы, содержащей карбоксильную группу в связанном состоянии в виде карбоксибиотина, и превращается в щавелевоуксусную кислоту:

	О (1) \\ СН3–С–СООН + С–N=фермент ¾¾® СН2–СООН + HN=фермент || / | О НО СО–СООН пировиноград- карбоксилирован- щавелевоук- ная кислота ный фермент сусная кислота

В последующих реакциях щавелевоуксусная кислота последовательно превращается сначала в яблочную и затем в фумаровую и янтарную кислоты:

	НАД+ ФАД (2) СН2–СООН НАД×Н+Н+ СН2–СООН СН–СООН ФАД×Н2 СН2–СООН | ¾¾¾¾¾® | ¾¾® || ¾¾¾¾¾® | СО–СООН СНОН–СООН СН–СООН СН2–СООН щавелевоуксус- яблочная Н2О фумаровая янтарная ная кислота кислота кислота кислота

На образовавшуюся янтарную кислоту переносится группировка КоА ферментом КоА-трансферазой с образованием сукцинил-КоА:

	СН2–СООН СН2–СООН (3) | + КоА–фермент ¾¾® | + фермент СН2–СООН СН2–С~S–КоА ятарная || кислота О сукцинил-КоА

На следующей стадии брожения сукцинил-КоА изомеризуется в метилмалонил-КоА. Реакцию катализирует В₁₂–зависимый фермент метилмалонил-КоА-мутаза. Затем происходит пространственная изомеризация полученного продукта специфической рацемазой, в ходе которой изменяется пространственное положение свободной карбоксильной группы.

	СН2–СООН метилмало- Н3С О Н3С О (4) | нил-КоА-мутаза \ // рацемаза \ // СН2–С~S–КоА ¾¾¾¾¾¾¾® С – С~S–КоА ¾¾¾® С – С~S–КоА || / \ / \ О НООС Н Н СООН сукцинил-КоА R-изомер S-изомер

Полученный в ходе изомеризации S-изомер метилмалонил-КоА в следующей реакции декарбоксилируется, передавая карбоксильную группу на карбоксилтрансферазу, которая её переносит на пировиноградную кислоту, как показано в реакции 1. Продукты этой реакции – пропионил-КоА и карбоксилированный фермент:

	Н3С О \ // N=фермент С – С~S–КоА + НN-фермент ¾® СН3–СН2–С~S–КоА + ‌ / \ || С Н СООН О // \ пропионил-КоА О ОН

В последней реакции с участием КоА-трансферазы осуществляется перенос группировки КоА от пропионил-КоА на янтарную кислоту, в результате образуются пропионовая (пропановая) кислота и сукцинил-КоА:

	СН2–СООН КоА-транс- СН2–СООН СН3–СН2–С~S–КоА + | ¾¾¾¾® СН3–СН2–СООН + | || СН2–СООН фераза пропионовая СН2–С~S–КоА О кислота || О пропионил-КоА янтарная кислота сукцинил-КоА

Образовавшийся сукцинил-КоА снова включается в реакции брожения, а пропионовая кислота – конечный продукт пропионовокислого брожения. Кроме пропионовой кислоты в этих реакциях образуется также уксусная кислота путём фосфоролитического расщепления молекул ацетил-КоА, в ходе которого осуществляется синтез АТФ. Кроме того, в составе продуктов пропионовокислого брожения содержится небольшое количество янтарной кислоты. Пропионовокислые бактерии особенно многочисленны в преджелудках жвачных животных, они также участвуют в химических процессах, лежащих в основе получения сыра.

Процессы брожения, проходящие в природной среде, как правило, осуществляются с участием разных видов микроорганизмов. При этом продукты одних видов микроорганизмов могут служить субстратами для других видов. Поэтому в ходе брожения образуется сложная смесь продуктов, которая постоянно изменяется в зависимости от состава микроорганизмов и условий окружающей среды.

Для реализации промышленных технологий брожения используются чистые культуры отселектированных клонов микроорганизмов, способных обеспечить наиболее полный выход целевого продукта и меньшее образование побочных химических веществ. Кроме того, в процессе реализации промышленной технологии путём направленного воздействия предотвращаются ответвления биохимических путей, которые являются источниками образования побочных продуктов.