Изучение процесса использования неорганического фосфата в процессе гликолиза

Целью данной работы является знакомство на практике с одним из традиционных методов количественного определения фосфора в объектах биологического происхождение и выявление снижения концентрации неорганического фосфора в культуральной жидкости за счет его потребления в процессе гликолиза дрожжевыми клетками.

В данной работе используется классический метод определения неорганического фосфора по Фиске – Суббароу.

Метод позволяет определить от 0,2 до 2 мкмолей неорганического фосфата в пробе. Определение неорганического фосфата проводят прямо из исследуемого раствора. Если в исследуемом растворе содержится белок, то необходимо его предварительно удалить.

Для исследования используют два раствора. Первый образец представляет собой свежеприготовленную питательную среду с определенной концентрацией неорганического фосфата, необходимого для культивирования дрожжей рода S. сerevisiae. Второй образец представляет собой культуральную жидкость, оставшуюся после трехчасового культивирования в ней дрожжевых клеток. Как известно, в процессе гликолиза, лежащего в основе спиртового брожения у дрожжей, происходит потребление неорганического фосфата и включение его в состав органических молекул (образование 1,3 дифосфоглицериновой кислоты).

Таким образом, для определения количеств использованного в процессе гликолиза фосфора необходимо определить его концентрацию в культуральной жидкости до и после процесса культивации клеток. Для этого при исследовании второго образца в нем предварительно производят осаждение клеток путем центрифугирования при 3000 об./мин. в течение 4 минут, после чего надосадочную жидкость дополнительно фильтруют через бумажный фильтр и в полученном фильтрате определяют концентрацию неорганического фосфата.

Реактивы:

1. (МН₄)₂МоО₄ - 2,5 % -ный раствор.

2. H₂SO₄ - 5 н. раствор.

3. Молибденовый реактив - смесь равных объемов молибденовокислого аммония (1) и серной кислоты (2).

4. Эйкологен ( 1,2,4 - аминонафтолсульфоновая кислота);основной раствор: 250 мг эйконогена, 15 г NaHSO₃ (илиNa₂S₂O₅, 14 г) и 0,5 г Na₂SO₃ растворяют в 100 мл воды. Раствор можно хранить в темной склянке длительное время.

Рабочий раствор эйконогена: 1 объем основного раствора и 4 объема дистиллированной воды, хорошо перемешивают, если необходимо, фильтруют. Раствор может храниться в темноте несколько дней.

5. Стандартный раствор фосфата (КН₂РО₄), содержащий 2 мкмоля фосфата в 1 мл. В качестве антисептика к раствору добавляют 1 - 2 капли хлороформа.

б. Магнезиальная смесь - 20 г МgСl₂*бН₂О и 40 г NH₄C1 растворяют в 200 мл воды и добавляют 20 мл концентрbрованного аммиака.

7. Фенолфталеин - 0,5%-ный спиртовой раствор.

8. КОН - 10%-ный раствор.

9. СС1₃СООН - 5%-ный раствор.

10. НС1О₄ - 5%-ный раствор

Ход работы

ОПЫТ №1. Определение содержания неорганического фосфора в культуральной жидкости до проведения процесса культивирования дрожжей

Определение производят минимум в двух параллелях. Для исследования берут 1 мл свежеприготовленной культуральной жидкости (образец № 1), содержащему от 0,2 до 2 мкмолей неорганического фосфата, к нему добавляют 1,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл молибденовой смеси. Содержимое пробирок хорошо перемешивают.

Затем во все пробы добавляют по 1 мл рабочего раствора эйконогена, все снова перемешивают и помещают в водяную баню при 37°С на 10 - 15 мин (или оставляют при комнатной температуре на 30 - 40 мин.). После этого раствор охлаждают и фотометрируют при 625 нм.

Содержание фосфата в пробе рассчитывают по калибровочному графику. Для построения графика проводят определение фосфора в стандартном растворе КН₂РО₄, беря различные его количества в пределах чувствительности данного метода, а именно от 0,2 до 2 мкмолей фосфата в пробе для колориметрирования (5 мл). По результатам фотометрирования стандартного раствора фосфата строят график зависимости интенсивности окраски от количества взятого вещества. По оси ординат откладывают значения (оптической плотности) по оказанию ФЭКа, а по оси абсцисс - количество фосфата в данной пробе. Калибровочный график должен иметь вид прямой, выходящей из начала координат.

Необходимо помнить, что интенсивность окраски определяется концентрацией фосфора, по зависит также от температуры и времени развития окраски. Поэтому при колориметрировании необходимо придерживаться определенных стандартных условий.

ОПЫТ №2. Определение содержания неорганического фосфора в культуральной жидкости после проведения процесса культивирования дрожжей

Для определения концентрации неорганического фосфата в образце № 2 сначала производят удаление из него дрожжевых клеток. Эта процедура осуществляется с помощью центрифугирования с последующей фильтацией (см. выше).

После этой прпоцедуры из исследуемого раствора необходимо удалить белки, которые могут оказаться в культуральной жидкости. По этой причине определение фосфора в образце № 2 необходимо производить в два этапа.

2.1. Удаление белков из исследуемой жидкости

Белки из исследуемого раствора осаждают трихлоруксусной или хлорной кислотой, добавляя ее к раствору до конечной концентрации 2,5%. Раствор хорошо перемешивают, осадок белка удаляют фильтрованием или центрифугированием.

От трихлоруксусной кислоты можно освободиться путем повторного встряхивания раствора с 5 - 10-кратным объемом насыщенного водой эфира. Трихлоруксусная кислота переходит при этом в эфирную фракцию. После встряхивания и отстаивания эфир отсасывают водоструйным насосом.

Хлорную кислоту удаляют в виде калиевой соли (KClO₄), образующейся при нейтрализации раствора концентрированным КОН. После добавления КОН раствор хорошо охлаждают и осадок удаляют центрифугированием на холоде. Растворимость KClO₄ при 0°С очень мала.

Вместо процедуры по удалению кислот безбелковый раствор можно просто нейтрализовать щелочью. При этом необходимо определить конечный объем пробы.

2.2. Определение концентрации неорганического фосфата

Эта процедура происходит в соответствии с вышеизложенным (см. п.1).

ОПЫТ №3.Определение количества неорганического фосфата, потребленного дрожжевыми клетками в процессе культивирования

По калибровочному графику определяется количество фосфора в обоих образцах и по разнице между этими величинами рассчитывается количество фосфора, потребленного в процессе гликолиза.

Лабораторная работа №8

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ.