Проверка активности экстракта сахаразы

Оборудование: 1) штатив с пробирками, 2) пипетки, 3) спиртовка,4) водяная баня, 5) термометр.

Реактивы: 1) сахароза 2%-ный раствор, 2) экстракт сахаразы, 3) реактив Фелинга.

Ход работы

В две пробирки берут по 1 мл экстракта сахаразы. Одну из пробирок нагревают до кипения, чтобы разрушить фермент. После охлаждения в обе пробирки прибавляют по 2-3 мл 2%-ного раствора сахарозы и ставят на водяную баню при 40^оС на 10-15 мин., после чего вынимают пробирки из бани, охлаждают. Добавляют в каждую 1мл реактива Фелинга. Верхний слой жидкости нагревают до кипения. Появление желтого, затем красного осадка указывает на наличие в пробе моносахаридов, т.е. на произошедшее расщепление сахарозы ферментом сахаразой.

ОПЫТ 3.

Выявление специфичности действия ферментов.

Оборудование: 1) штатив с пробирками, 2) водяная баня с термометром, 3) пипетки,

4) капельница с раствором Люголя.

Реактивы: 1) разбавленная слюна, 2) экстракт сахаразы, 3) 1%-ный раствор крахмала,

4)2%-ный раствор сахарозы, 5)реактив Фелинга, 6) раствор Люголя.

Ход работы.

Перед началом работы готовят раствор разбавленной слюны. Для этого, ополоснув рот дистиллированной водой и выплюнув ее в раковину, набирают в рот дистиллированную воду повторно и держат ее во рту 2...3 мин. Качество приготовленной разбавленной слюны зависит от того, давно ли человек ел и голоден ли он. Желательно чтобы тот студент, который готовит слюну, за 0.5 часа до этого не курил и не жевал жевательную резинку.

Берут четыре пробирки, в пробирки N1 и N3 наливают по 4-5 мл раствора крахмала, а в пробирки N2 и N4 по 4-5 мл раствора сахарозы. Затем в пробирки N1 и N2 приливают по 2 мл разбавленной слюны, а в пробирки N3 и N4 - по 2 мл раствора сахаразы.

Все пробирки помещают в водяную баню (Т=38^о-40^оС) на 10-15 минут, не забывая периодически перемешивать содержимое пробирок встряхиванием для лучшего взаимодействия фермента с субстратом. После указанного срока пробирки вынимают из бани и охлаждают.

Содержимое пробирок N1 и N3 разливают на две части (пробирки 1 и 1а; пробирки 3 и 3а).

А. ОБНАРУЖЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ.

В пробирки NN 1,2,3, 4 прилить 1мл реактива Фелинга и нагреть верхний слой. Появление желтого, а затем красного окрашивания указывает на наличие в растворе глюкозы. Результаты занести в табл.I ( знаком "+" обозначив наличие в растворе глюкозы, знаком "- " - ее отсутствие).

Таблица I.

N про- бирки	Субстрат	Фермент	Наличие в растворе глюкозы
	Крахмал Сахароза Крахмал Сахароза	Амилаза Амилаза Сахараза Сахараза

Б. ОБНАРУЖЕНИЕ КРАХМАЛА

В пробирках NN 1а и 3а проводят качественную реакцию на крахмал для чего добавляют в каждую пробирку по 1-2 капли раствора Люголя. Результаты заносят в табл.II, обозначив наличие нерасщепленного крахмала в пробе знаком "+" и знаком "-" гидролизованный крахмал.

Таблица II.

N про- бирки	Субстрат	Фермент	Наличие крахмала в пробе
	Крахмал Крахмал	Амилаза Сахараза

На основе результатов эксперимента делают соответствующие выводы.

Лабораторная работа №5

Количественное определение -каротина в растительном материале методом распределительной хроматографии

Каротин относится к группе каротиноидов-желтых и оранжевокрасных пигментов, построенных из восьми остатков изопрена и имеющих общую формулу С₄₀Н₅₆.

Известно по крайней мере 5 изомеров каротина, которые обоз­начают буквами греческого алфавита. Все они биологически активны, так как при их расщеплении с участием воды в организме человека и животных образуется витамин А. Наибольшей биологической активностью обладает b-каротин. При расщеплении молекулы b-каротина с присоединением воды образуется 2 молекулы витамина А (С₂₀Н₂₅ОН). Каротин нерастворим в воде, но растворяется в некоторых органических веществах.

Принцип метода:

Каротин экстрагируют из растительного материала ацетоном, затем переводят в петролейный эфир и отделяют от других пигментов методом распределительной хроматографии на колонках с окисью алюминия. Количество каротина определяют колориметрически по интенсивности желтой окраски путем сравнения с раствором азобензола (или бихромата калия), стандартизованного по каротину.

Оборудование:

1.Фотоэлектроколориметр или спектрофотометр

2.Ступка фарфоровая с пестиком

3.Воронка делительная

4.Колба Бунзена

5.Воронка Бюхнера

6.Колонки хроматографические- 2 шт

7.Колбы мерные на 50 и 100 мл

8.Колба коническая

Реактивы:

1.Карбонат натрия (крист.)

2.Оксид кальция (крист.)

3.Сульфат натрия безводный

4.Оксид алюминия с влажностью 4% (окись алюминия высушивают при 105^ОС и увлажняют по расчету, хранят в банке с притертой крышкой)

5.Петролейный эфир

6.Стандартный раствор азобензола или бихромата калия

7.Ацетон

Ход определения:

5-10 г измельченного свежего растительного материала растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком. Каротин распадается в кислой среде, поэтому при растирании добавляют немного Na₂CO₃ (все операции по экстракции и очистке каротина желательно проводить при рассеянном свете, в токе углекислого газа или азота).

Каротин экстрагируют ацетоном, повторяя растирание навески и экстракцию несколько раз (пока экстракт не станет бесцветным). Обычно используют 5- кратное (по отношению к навеске) количество ацетона. Все ацетоновые экстракты сливают в стаканы, а затем фильтруют при отсасывании. Фильтр промывают небольшим количеством ацетона и количественно переносят в делительную воронку.

Хроматографическое разделение экстрагированных пигментов на окиси алюминия проводят с использованием в качестве растворителя петролейного эфира. Поэтому необходимо, чтобы пигменты сконцентрировались в этом растворе. Чтобы перевести пигменты в петролейный эфир, в делительную воронку приливают 10-20 мл этого растворителя, добавляют для лучшего разделения несколько миллилитров воды и кристаллик хлористого натрия, воронку встряхивают и оставляют до полного разделения слоев. Нижний (водно-ацетоновый) слой сливают. Воду приливают несколько раз до полного удаления слоев ацетона.

Для обезвоживания раствор пигментов в петролейном эфире пропускают через колонку, наполненную безводным Na₂SO₄. Дальнейшее отделение каротина от сопутствующих пигментов проводят мето­дом адсорбционной хроматографии на окиси алюминия. Для этого на дно хроматографической колонки помещают ватный тампон толщиной около 1 см. Затем в колонку небольшими порциями вносят окись алюминия влажностью 4%, слегка постукивая по колонке стеклянной палочкой и уплотняя адсорбент. Высоту слоя адсорбента доводят до 7-10 см. После этого в колонку кладут слой ваты и вносят безводный сульфат натрия слоем 0.5 см. Раствор каротина в петролейном эфире медленно (со скоростью 60 капель в мин) пропускают через хроматографическую колонку при слабом разрежении. При этом надо следить, чтобы над поверхностью адсорбента все время был слой растворителя, так как каротин на воздухе окисляется. Затем через колонку пропускают чистый петролейный эфир до тех пор, пока весь

каротин, отделяясь от двух пигментов, в виде желтой полосы неперейдет в приемник. Промывание колонки заканчивают, когда выте­кающий растворитель станет прозрачным. Раствор каротина переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят петролейным эфиром до метки.

Содержание каротина определяют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине волны 440 нм, сравнивая со стан­дартным раствором азобензола или бихромата калия.

Вычисление результатов:

Количество каротина вычисляют по формуле:

a*D1*V*100

Х= ------------,

D2*n

где Х - содержание каротина, мг/100 г

а - количество миллиграммов каротина в 1 мл, которому соответствует стандартный раствор (0.00235 мг, если был взят азобензол и 0.00416 мг, если был взят бихромат

калия)

D₁- оптическая плотность исследуемого раствора

D₂- оптическая плотность стандарта

V - объем раствора каротина, мл

n - навеска растительного материала, г

Лабораторная работа №6

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА И УДЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПИРОВИНОГРАДНОИ КИСЛОТЫ В КРОВИ И ТКАНЯХ