Построение калибровочной прямой.
Для определения количественного содержания белка в пробе необходимо иметь калибровочный график, связывающий показания оптической плотности с концентрацией белка.
Калибровочную кривую необходимо строить для того белка, с которым предполагается работать, т.к. разные белки дают разные показания оптической плотности при равной концентрации.
1. Исходный стандартный раствор белка с концентрацией С = 9,6 мг/мл
2. Для построения графика используются четыре точки с разными концентрации белка: 9,6 мг/мл, 7,2 мг/мл, 4,8 мг/мл, 2,4 мг/мл(для научно-исследовательских целей обычно используют большее число точек).
Для получения этих точек необходимо произвести различные разведения стандартного раствора, т.е. приготовить ряд разведений
3.Приготовление разведений белка
| № проб | Объем станд. раствора /мл/, С0=9.6 мг/мл | Объем воды /мл/ | С /мг/мл/ | Е оптич.плотность или экстинкция |
| - - - | 9.6 9.6 9.6 | |||
| 0.75 0.75 0.75 | 0.25 0.25 0.25 | 7.2 7.2 7.2 | ||
| 0.50 0.50 0.50 | 0.50 0.50 0.50 | 4.8 4.8 4.8 | ||
| 0.25 0.25 0.25 | 0.75 0.75 0.75 | 2.4 2.4 2.4 | ||
| 13 (контр.) | - | 2.00 | 0.00 |
4. Во все двенадцать пробирок прилить по 4 мл биуретового реактива, а в контрольную пробирку - 8 мл, т.к. содержимое контрольной пробы при работе на ФЭКе должно быть разлито в две кюветы.
5. Все пробирки поместить на 30 минут в затемненное место для развития окраски .
6. Произвести измерения на ФЭКе при длине волны = 540нм (фильтр 7) в кюветах, толщиной 10 мм и записать полученные показания в таблицу в тетради.
7. Построение калибровочного графика.
Количественное определение белка в задаче №1.
В три пробирки налить по 1 мл исследуемого раствора(задача 1) , содержащего 2-10 мг белка, прилить по 4 мл биуретового реактива, выдержать пробы в затемненном месте в течение 30 мин и колориметрировать на ФЭКе при 540 нм ( фильтр 7)
Содержание белка в растворе рассчитывают по калибровочному графику, связывающего показания оптической плотности с концентрацией белка в пробах.
Количественное определение белка спектрофотометрическим методом.
Для выполнения этого задания выдается проба(задача 2), содержащая неизвестное количество белка. Определите его концентрацию, пользуясь приведенной номограммой.
ПОРЯДОК ИЗМЕРЕНИЯ НА СФ:
1. Включить прибор и подождать около 30 мин до полного накаливания УФ-лампы.
2. Поставить в соответствующие пазы кюветы с раствором белка(опытная проба) и с растворителем(контрольная проба).
3. Поместить контрольную пробу в световой пучок и открыть шторки рукояткой "откр".
4. Подогнать стрелку прибора к нулевому значению (нижняя шкала) рукояткой регуляции ширины щели.
5. Закрыть шторки ("закр").
6. Поставить кювету с опытной пробой в световой поток и открыть шторку.
7. Считать показания прибора (нижняя шкала). Записать результат.
ВНИМАНИЕ! Для измерения концентрации белка все измерения производятся два раза: при 280 и 260 нм.
Вопросы:
1. В чем принципиальное различие между тремя предложенными Вам методами измерения количественного содержания белка?
2. Почему не всегда можно пользоваться этими методами?
3. Почему пользуясь спектрофотометрическим методом необходимо производить измерения при двух длинах волн?
4. Почему пользуясь колориметрическим методом (биуретовым) необходимо иметь калибровочные графики для определенного белка, с которым ведется работа?
5. В чем неудобства метода Лоури?
Лабораторная работа №2
Изучение некоторых общих свойств ферментов
ОПЫТ 1.
Сравнительное действие неорганических катализаторов и ферментов.
Биокатализаторы и катализаторы, характерные для неорганического мира, различаются не по сущности катализа. Это различие состоит в том, что ферменты имеют более сложное строение, чем неорганические катализаторы, что и обеспечивает очень высокую степень их специфичности, большую чувствительность, активность и лабильность.
Приборы: 1. Штатив с пробирками.
2. Пипетки.
3. Водяная баня с термометром.
Реактивы: 1. 1%-ный раствор крахмала на 0.3%-ном растворе NaCl.
2. 10%-ный раствор HCl.
3. Раствор Люголя.
4. Разбавленная слюна.
Ход работы.
Перед началом работы готовят раствор разбавленной слюны. Для этого, ополоснув рот дистиллированной водой и выплюнув ее в раковину, набирают в рот дистиллированную воду повторно и держат ее во рту 2...3 мин. Качество приготовленной разбавленной слюны зависит от того, давно ли человек ел и голоден ли он. Желательно чтобы тот студент, который готовит слюну, за 0.5 часа до этого не курил и не жевал жевательную резинку.
В три пробирки наливают по 5 мл 1%-ного раствора крахмала. Затем в 1-ю пробирку добавляют 1 мл дистиллированной воды, во вторую- 1 мл 10%-ной HCl, а в третью- 1мл слюны. Содержимое пробирок 1 и 3 размешивают и ставят на водяную баню при 38ОС, а пробирку Nо2 - в кипящую водяную баню. Через 15...20 минут все пробирки вынимают из водяной бани, охлаждают и добавляют туда 1...2 капли раствора Люголя. В растворе Люголя содержится иод, в присутствии которого крахмал (не расщепленный) имеет синий цвет. Если в пробирке наблюдается фиолетовое окрашивание – это значит, что расщепление находится на первоначальном этапе, красновато-бурое окрашивание свидетельствует о более полном расщеплении крахмала. Буро-желтое - об окончательном расщеплении.
Полученные результаты заносят в следующую таблицу:
| Nо пробирки | Субстрат | Катализатор | Окрашивание р-ра |
| Крахмал Крахмал Крахмал | ------- Соляная кислота Амилаза слюны |
ОПЫТ 2.
Термолабильность ферментов
При реакциях, катализируемых ферментами, как при химических реакциях вообще, по мере повышения температуры растет реакционная способность. Но так как ферменты являются белками, которые при высокой температуре могут необратимо денатурироваться, то для ферментативного действия характерно, что повышение скорости реакции идет при повышении температуры до определенного значения, а затем, при дальнейшем повышении температуры скорость снижается. Температурный оптимум большинства ферментов животного тела близок к температуре тела и лежит в пределах 37...40ОС. Особая чувствительность ферментов к температуре является одним из свойств, качественно отличающих эти биокатализаторы от неорганических катализаторов. При низкой температуре приостанавливается ферментативная деятельность. Этот процесс обратим.
Приборы: 1. Штатив с пробирками.
2. Стакан со льдом.
3. Спиртовка.
4. Водяная баня с термометром.
Реактивы: 1. 1%-ный раствор крахмала на 0.3%-ном растворе NaCl.
2. 10%-ный раствор HCl.
3. Раствор Люголя.
Ход работы.
В опыте используются 4 температурных режима (0ОС, комнатная температура, 37ОС, 80ОС).
В четыре пробирки наливают по 5 мл раствора крахмала и добавляют по 2...3 мл разбавленной слюны. Перемешивают содержимое каждой пробирки и ставят первую пробирку в сосуд со льдом ( 0ОС ) и в морозильную камеру, вторую оставляют в штативе при комнатной температуре на лабораторном столе, третью и четвертую помещают в водяные бани при температуре 37 и 80ОС. Значение всех температур во время опыта постоянно фиксируется.Через 10 мин пробирки, помещенные в баню, охлаждают и во все (4) пробирки добавляют 1...2 капли раствора Люголя. Отметить окраску растворов. Если теперь поместить пробирку Nо1 в водяную баню при 38...40 ОС на 10 минут, то произойдет гидролиз крахмала, что и покажет изменение цвета раствора. Таким образом, может быть показана обратимость тормозящего действия низкой температуры на активность фермента.
ОПЫТ 3.