Определение различных форм азота в молоке и сыре

Наличие различных форм азота в молоке и сырах различного вида может служить критерием их качества и контролем за правильностью хода технологического процесса. Например, повышенное или пониженное содержание различных форм азота в цельном молоке может служить, наряду с другими методами биохимического и микробиологического анализа, критериями состояния фальсификации молока. Изменения в содержании различных форм азота в созревающих сырах может служить основой для заключения о степени нарушения технологического процесса, наличия в активной в протеолитическом отношении посторонней микрофлоры, нарушения температурного режима созревания сыров, правильности хода вкусо- и ароматообразования в сырах и т.д. Например, повышенное содержание белковых соединений в молоке при параллельном снижении содержания жира в нем и нормальной плотности может указывать на фальсификацию молока, заключающуюся в удалении сливок при параллельном внесении обрата. Нормальное содержание белка при нормальной плотности и пониженном количестве жира может указывать на наличие в молоке липолитической активности посторонней микрофлоры и т.д.

Степень распада белков при созревании сыров определяют, исследуя содержание в них отдельных фракций азотистых оснований. Белкипод влиянием сычужного фермента и ферментов молочнокислых бактерий сырной массы распадаются с образованием многочисленных азотистых соединений сыра. При распаде белков в сырах накапливаются пептиды и свободные аминокислоты, существенно влияющие на вкус готового продукта. В первой половине созревания в сырах вследствие образования большего количества пептидов с различной молекулярной массой появляется горький привкус, затем по мере гидролиза пептидов он обычно исчезает. В процессе созревания твердых сыров суммарное количество аминокислот непрерывно увеличивается, а концентрация других, достигнув максимума, снижается. В сырах часто отсутствует аргинин, серин и метионин. Уменьшение количества или исчезновение некоторых аминокислот свидетельствует о дальнейшем их распаде или превращениях в новые аминокислоты, большинство из которых под действием дегидрогиназ, декарбоксилаз, трансаминаз и других ферментов микроорганизмов дезаминируется, декарбоксилируется, вступает в реакцию переаминирования и подвергается другим изменениям.

Образующийся в результате ряд химических соединений играет большую роль в формировании вкуса и аромата сыра: карбоновые кислоты, окси- и кетокислоты, альдегиды, кетоны, амины, азотистые гетероциклы.

В предлагаемой работе студенты получают различные образцы молока и по содержанию белка, молочного жира и плотности делают заключение о возможной фальсификации молока исходя из того, что среднее содержание жира в молоке составляет 3,5±0,5%, величина плотности “Д” находится в пределах от 28 до 30°С.

При определении состояния различных форм азота в анализируемых образцах сыра студент при завершении анализов должен сделать заключение о нормальности или ненормальности хода созревания сыров. А также уметь объяснить возможные причины возникновения этих процессов, исходя из того, что средние величины для мягких и твердых сыров со сроком созревания от 1,5 до 2 месяцев должны быть следующими (в % к общему азоту): общий растворимый азот 22-67; растворимый небелковый азот – от 5 до 8; азот пептидов, аминокислот, амидов, аммиака – от 4 до 6; азот полипептидов 1- 2.

Азотистые соединения сыра

(общий азот)

__________________________________________

Нерастворимые в воде азотистые Растворимые в воде азотистые

соединения (азот нерастворимый) соединения (общий растворимый азот)

Растворимые белковые вещества - Растворимые небелковые вещества –

азотистые соединения, осаждаемые азотистые соединения, не осаждаемые уксусной и трихлоруксусной кислотой уксусной и ТХУ кислотой

(растворимый белковый азот) (растворимый небелковый азот)

Растворимые азотистые соединения, Растворимые азотистые

осаждаемые танином и спиртом соединения, не осаждаемые

(азот пептидов) танином и спиртом

(азот аминный и аммиачный)

Рисунок 3 - Разделение азотистых соединений сыра

4.2.1 Метод определения общего количества азота в сыре

Ход работы. Отвешивают с точностью до 0,001 г 2 г пробы сыра, переносят ее в фарфоровую ступку и тщательно растирают, постепенно приливая небольшими порциями 50 мл 1%-ного раствора нейтрального, лимоннокислого натрия, нагретого до 35-40⁰С. Полученный раствор переливают в мерную колбу на 100 мл через воронку, обмывая ступку, пестик и воронку раствором лимоннокислого натрия, охлаждают до 20⁰С и доводят водой до метки.

В колбу Кьельдаля емкостью 250 мл отмеривают пипеткой 5 мл приготовленного раствора (это соответствует 0,1 г сыра и сжигают его с 5-7 мл селенового катализатора). Во избежание сильного вспенивания жидкости при нагревании в колбу Кьельдаля вносят несколько кусочков твердой обожженной глины (кусочки кирпича, керамики и пр.) Колбу под углом 40⁰ помещают в вытяжной шкаф на асбестовую с электрическим нагревом сетку. Во избежание выкипания и разбрызгивания жидкости в горло колбы Кьельдаля вставляют стеклянную грушу или небольшую воронку, выходящие пары воды и серной кислоты конденсируются на ней и стекают обратно. Это позволяет избежать потерь при сжигании.

Вначале нагревание ведут осторожно, а затем, удалив асбестовые сетки, сильно нагревают до полного исчезновения темной и бурой окраски. Сжигать белковые вещества следует не менее двух часов. Прозрачная жидкость после сжигания примет зеленоватый или слегка желтоватый оттенок с совершенно белым осадком и нагревание колбы продолжают еще час. Содержимое колбы охлаждают до 20 ⁰С, добавляют 10 мл воды и содержимое переносят в аппарат для отгонки аммиака. После этого колба ополаскивается еще два раза по 3 мл дистиллированной водой. Промывные воды тоже переносят в аппарат для отгонки аммиака. Отгонку аммиака проводят на приборе Сереньева (см. рисунок 2).

Количество азота рассчитывают по формуле

, (4)

где N – содержание общего азота в пересчете на сухое вещество, %;

V– количество титрованного раствора, израсходованного на титрова- ние опытной пробы, мл;

V₁– количество титрованного раствора, израсходованного на титрова- ние контрольной пробы, мл;

n – заданная нормальность титрованного раствора;

k – поправка на нормальность титрованного раствора;

g – навеска анализируемой пробы (сыра), г;

W – влажность исследуемого образца, %;

0,014 – титр 1н раствора Н₂SО₄, г/см³.

4.2.2 Метод определения общего количества растворимого азота

Ход работы. Отмеривают 100 мл дистиллированной воды в стакан и подо-гревают до 35-40⁰С. Отвешивают 2 г подготовленной пробы сыра, переносят без потерь в фарфоровую ступку и тщательно растирают с 3-4 мл воды из отмеренного количества, продолжая растирание, постепенно приливают еще около 15 мл воды.

Полученную эмульсию сливают в стакан емкостью 250 мл, остатки сыра в ступке снова растирают с теплой водой и эмульсию опять переносят в стакан. Ступку и пестик тщательно смывают водой и остаток сыра переносят в тот же стакан вместе с оставшимся количеством воды из отмеренных 100 мл. Оставляют содержимое на 1 час, перемешивая несколько раз, охлаждают до 20⁰С. Отстоявшийся и застывший жир снимают, жидкость фильтруют через ватный фильтр, затем через складчатый бумажный, возвращая первые порции фильтрата обратно на фильтр; 1 мл полученной водной вытяжки содержит растворимые азотистые вещества из 0,02 г сыра (фильтрат I).

Из полученной водной вытяжки отмеривают пипеткой 5 мл (соответствует 0,1 г сыра) в колбу Кьельдаля для сжигания, прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты и катализатор селена. Осторожно, не закрывая колбу, выпаривают воду при слабом нагревании. Когда в колбе останется 3-4 мл жидкости и раствор почернеет, добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и далее ставят на сжигание. Отгонку аммиака производят на приборе Сереньева.

Количество растворимого азота рассчитывают по формуле (4).

4.2.3 Метод определения азотосодержащих небелковых соединений

Ход работы. Прежде чем определить содержание небелкового азота в полученном фильтрате I, необходимо осадить трихлоруксусной кислотой белковые вещества. (Трихлоруксусная кислота осаждает белковые соединения, а небелковые азотистые соединения остаются в растворе). Для этого отмеривают в мерную колбу на 100 мл (или химический стакан) пипеткой 50 мл полученного фильтрата I, затем добавляют 15 мл 50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и до метки 35 мл дистиллированной воды. Перемешивают и оставляют содержимое на 20-30 мин для осаждения белков, несколько раз перемешивая. Смесь фильтруют через сухой бумажный фильтр. Прозрачный фильтрат II анализируют на содержание растворимых небелковых азотистых веществ. 10 мл фильтрата II соответствует навеске 0,1 г сыра.

В колбу Кьельдаля емкостью 250 мл отмеривают пипеткой 10 мл приготовленного раствора. В эту же колбу осторожно по стенке вливают 10 мл концентрированной серной кислоты и добавляют 10-20 мг селенового катализатора. В горлышко колбы вставляют небольшую воронку или стеклянную грушу. В вытяжном шкафу вначале при слабом нагревании на асбестовой сетке, а потом при более сильном кипячении содержимое колбы доводят до полного растворения.

После сжигания отгонку аммиака проводят на приборе Сереньева.

Общее количество растворимого небелкового азота рассчитывают по формуле (4).

4.2.4 Метод определения аминного азота (пептиды, аминокислоты,
амиды, аммиак)

Ход работы. В цилиндр на 50 мл отмеривают 20 мл безбелкового фильтрата водной вытяжки сыра, полученного после осаждения белков трихлоруксусной кислотой (фильтрат II). Затем добавляют 1 каплю 0,2%-ного раствора метилового красного, 4 мл 8%-ного водного раствора едкого натра и постепенно 0,1н раствора едкого натра до появления слабо-оранжевого окрашивания (рН 5,5-5,8).

В смесь вносят 0,3 г хлористого натрия и добавляют 20%-ный раствор танина до полного осаждения полипептидов (2 мл). Доводят объем до 50 мл дистиллированной водой, оставляют на 20-30 мин. После фильтрования через сухой фильтр получают прозрачный фильтрат, в котором определяют содержание азота. На сжигание берут 20 мл фильтрата, что соответствует 0,1 г сыра, и анализируют его, как и при определении растворимого белкового и небелкового азота. После проведения процесса минерализации определяют аминный азот на приборе Сереньева.

Количество аминного азота рассчитывают по формуле (4).

Материалы и реактивы: сыр; концентрированная серная кислота; селеновый катализатор (см. приложение Б, п.8); 1%-ный раствор лимоннокислого натрия; 0,1н, 0,02н растворы Н₂SО₄; 0,1н, 8% и 40%-ные растворы NаОН; смешанный индикатор (см. приложение Б, п.7); 50%-ный раствор ТХУ (трихлоруксусная кислота); 0,2%-ный раствор метиленового красного (см. приложение Б, п.9); 20%-ный раствор танина; хлористый натрий.

Оборудование: колбы Кьельдаля на 250 мл; прибор Сереньева; пипетки на 5, 10, 20 мл; цилиндры на 5, 10, 50 мл; мерные колбы на 100, 250 мл; нагревательные плитки; аналитические весы; фарфоровые ступки; складчатые бумажные фильтры.