Количественное определение общего азота по методу Кьельдаля

Наиболее распространенным методом определения общего азота в биологическом материале является метод Кьельдаля. Основное его достоинство заключается в том, что он позволяет определить суммарный азот с высокой точностью. Несмотря на ряд модификаций, которые претерпел метод за свою историю, он, сохранив специфичность, стал стандартным методом определения азота. Однако из-за того, что отдельные участки его трудно поддаются автоматизации, метод и в настоящее время остается довольно трудоемким и длительным.

Принцип действия. При определении общего азота по Кьельдалю органическое вещество минерализуют при высокой температуре концентрированной серной кислотой. При этом органическое вещество окисляется в присутствии катализатора до СО₂ и Н₂О, а весь азот переходит в аммиак и связывается с серной кислотой, образуя сульфат аммония:

Азотосодержащее [О]

органическое (NН₄)₂SО₄ +СО₂ + Н₂О

соединение Н₂SO₄

Раствором щелочи нейтрализуют избыток серной кислоты и высвобождают из сернистого аммония аммиак:

(NН₄)₂SО₄ + 2NаОН Nа₂SО₄ + 2 NН₃ + 2 Н₂О,

который затем отгоняется с парами воды и улавливается стандартным раствором борной кислоты.

При взаимодействии аммиака и кислоты образуется борат аммония NН₄Н₂ВО₃:

NН₃ +Н₃ВО₃ NН₄⁺ + Н₂ВО₃^-

Борат титруют стандартным раствором серной кислоты, причем избыток Н₃ВО₃ не мешает определению:

Н⁺ + Н₂ВО₃^- Н₃ВО_3.

Отгон аммиака давлением водяных паров и титрование ведут на приборе конструкции В.М. Сереньева (см. рисунок 2), где можно совместить две заключительные стадии с целью ускорения определения азота.

Используемые для сжигания исследуемого материала катализаторы должны содержать сернокислый калий для повышения температуры сжигания вещества до оптимального значения.

Из-за трудоемкости процедуры выделения белка в анализируемой практике часто определяют так называемый сырой белок (сырой протеин), используя данные по содержанию общего азота (белкового и небелкового), считая его условно белковым. Так как содержание азота в белках колеблется в довольно широких пределах, а в среднем составляет 16%, то для пересчета азота на белок часто берут усредненный коэффициент – 6,25 (100:16 = 6,25). Этот коэффициент не является постоянным и в зависимости от содержания азота в белке у разных культур может изменяться от 5,3 до 6,25. Например, для пшеницы, ржи используют коэффициент 5,7 (100:17,5= 5,7). В целях получения сравнимых данных необходимо обязательно указывать коэффициент пересчета (N умножить на коэффициент пересчета).

Ход работы. 0,3- 0,5 г исследуемого воздушно-сухого материала отвешивают в маленькой пробирке (0,5х3 см), которую затем вставляют в резиновую трубку нужного диаметра и переносят в колбу Кьельдаля, вводя пробирку почти до основания перевернутой вверх дном колбы и опрокидывая всю систему. По разности масс пробирки с навеской и пустой пробирки (после переноса) определяют массу навески для анализа. В колбу добавляют 0,5 ± 0,05г смешанного катализатора и приливают цилиндром или дозатором 10 мл концентрированной Н₂SO₄. Перемешивают содержимое колбы (без встряхивания), закрывают ее стеклянной полой грушевидной втулкой или воронкой и ставят в наклонном положении (примерно 45⁰) в гнездо нагревателя в вытяжном шкафу. Колбу осторожно нагревают, снимая или уменьшая нагрев на некоторое время каждый раз, когда обугливаемое вещество начинает сильно пениться от выделяющихся газов, в том числе оксида серы (IV). После прекращения вспенивания можно усилить нагрев до слабого непрерывного кипения. Ввиду возможных потерь азота, вследствие разложения бисульфата аммония (сернокислый аммоний разлагается на аммиак и бисульфат при 355⁰С) необходимо следить, чтобы в процессе сжигания горло колбы всегда оставалось холодным, а также за тем, чтобы на стенках колбы не оставалось темных пятен, смывая их горячей кислотой, придав колбе наклонное положение. Когда содержимое колбы приобретает зеленовато-голубой цвет без желтого оттенка, ее кипятят еще около 20 минут, после чего в охлажденную на воздухе колбу добавляют небольшое количество воды для удаления следов кислоты со стеклянной втулки и внутренней стороны верхней части колбы, закрывают колбу резиновой пробкой или герметизируют другим способом и оставляют до определения азота. Отгон аммиака производят на приборе Сереньева (см. рисунок 2).

1 – реакционный сосуд ; 2 – воронка; 3 – барботер; 4 – сосуд со щелочью; 5 – бюретка; 6,7 – спускные краны; 8 – кран на свободный доступ воздуха; 9 – ЛАТР; 10 – штатив; 11 – электроды

Рисунок 2 – прибор Сереньева для определения азота

Методика работы на приборе Сереньева. После заполнения бюретки титрованным раствором до нулевой отметки, подачи воды к водоструйному насосу и холодильнику барботера 7 и подключения электродов подготовленного к работе сосуда через ЛАТР 9 в сетьзакрывают краны в следующей последовательности: нижний барботера 7, затем верхний, сообщая барботер с реактором 8 и, наконец, кран реактора 6. В барботер 3 вносят из бюретки 5 примерно 1/4 часть (1-2 мл) предполагаемого для титрования стандартного раствора 0,02н серной кислоты, содержащей индикатор Гроака.

В реактор 1 через фиксированную воронку подают минерализованный образец, обеспечив полноту переноса и отсутствие следов кислоты на воронке дистиллированной водой. При этом следят за тем, чтобы объем перенесенной жидкости был как можно меньшим, поскольку в этом случае время анализа уменьшается. Осторожно добавляют 33%-ный раствор гидроксида натрия до почернения смеси (работают в защитных очках).

Поступление аммиака с парами воды из реактора в барботер должно сопровождаться синхронным добавлением титрованного раствора (обеспечивается вручную) до границы перехода окраски в барботере с зеленой до лиловой (промежуточная окраска – сероватого тона). Постоянство лиловой окраски в течение 20–60 с (временный интервал зависит от скорости отгонки) свидетельствует о конце титрования. В бюретке отмечают объем израсходованного стандартного раствора и показание заносят в лабораторный журнал.

При необходимости продолжить работу после очередного измерения (например, проведение холостого опыта после анализа испытуемого образца или наоборот) уменьшают нагрев, открывают краны, сообщая систему с атмосферой, в последовательности реактор - барботер (верхний кран 6,8) – барботер (нижний кран 7). После слива жидкости из барботера и реактора промывают фиксированную воронку последнего дистиллированной водой (до 50 мл). Затем краны закрывают в обратной последовательности, заполняют бюретку стандартным раствором – и прибор вновь готов к работе.

По окончании работы отключают ЛАТР, открывают кран реактора 6, затем верхний кран барботера 8. После истечения жидкости из реактора промывают фиксированную воронку водой, закрывают верхний кран барботера 8, затем кран реактора 6 и заполняют реактор водой. Вновь открывают краны, сообщая систему с атмосферой, в последовательности реактор – барботер (верхний кран 6,8) – барботер (нижний кран 7) – предохранительная склянка. Отключают насос и перекрывают водопроводную воду для охлаждения. После слива жидкости из реактора и барботера извлекают подвижную часть затвора (пробку) крана, промывают кран водой, просушивают, смазывают борным вазелином и собирают кран.

Расчет содержания азота на сухое вещество в исследуемом материале проводится по формуле

, (2)

где N – содержание азота в пересчете на сухое вещество, %;

V - количество титрованного раствора 0,02н Н₂SО₄, израсходованного на титрование за вычетом поправки на реактивы (контрольная проба), мл;

n – заданная нормальность титрованного раствора;

k - поправка на нормальность титрованного раствора;

g – навеска анализируемой пробы, г;

W – влажность исследуемого вещества, %;

0,014 – титр1н раствора серной кислоты по азоту, г/см³.

Расчет содержания азота на воздушно - сухое в исследуемом материале проводится по формуле

, (3)

где N – содержание азота в пересчете на воздушно-сухое вещество, %;

V– количество титрованного раствора, израсходованного на титрова- ние за вычетом поправки на реактивы (контрольная проба), мл;

n – заданная н - нормальность титрованного раствора;

k – поправка на н - нормальность титрованного раствора;

g – навеска анализируемой пробы, г;

0,014 – титр1н раствора серной кислоты по азоту, г/см³.

Содержание белка рассчитывают путем умножения полученных значений азота на соответствующий коэффициент пересчета.

Материалы и реактивы: зерно, мука, солод; концентрированный раствор серной кислоты; 33%-ный раствор гидроксида натрия; смешанный индикатор Гроака (см. приложение Б, п.6); титрованный 0,02н раствор серной кислоты с индикатором Гроака и борной кислотой (см. приложение Б, п.7); селеновый катализатор (см. приложение Б, п.8).

Оборудование: колбы Кьельдаля; универсальная индикаторная бумага; цилиндры на 5, 10 мл; стеклянные втулки, воронки; пипетки на 20 мл; стаканы на 100 мл; промывалки; бумажные фильтры; пробирки с резиновой трубкой; прибор Сереньева для отгонки аммиака, защитные очки.