Глава iv. главное брожение и выдержка пива

При брожении сусла главным процессом является расщепление сахаров на спирт и углекислый газ, сопровождающееся значительным уменьшением величины экстракта. В начале процесса брожения это снижение идет медленно, затем ускоряется, что, по-видимому, обусловлено размножением дрожжей и повышением температуры (рис. 31).

Одновременно со сбраживанием сахаров происходит ассимиляция дрожжами азота из аминокислот, органических и неорганических аммонийных солей с образованием летучих и нелетучих кислот. Эти кислоты и угольная кислота, получаемая в результате спиртового брожения, повышают концентрацию водородных ионов, и pH понижается особенно резко в первые дни брожения.

Дальнейшей стабилизации pH способствуют те изменения буферности, которые вызываются метаболизмом дрожжей и, в частности, потреблением фосфатов.

Состав азотистых веществ в среде изменяется не только вследствие ассимиляции аминокислот дрожжами при их размножении, но и вследствие выделения дрожжевыми клетками азотистых веществ в результате их жизнедеятельности.

Повышение концентрации водородных ионов вызывает изменение дисперсности коллоидных частиц, коагуляцию высокомолекулярных белков на поверхности дрожжевых клеток и выделение их в деку. Изменение растворимости горьких веществ, находящихся в сусле после его охлаждения, сопровождается также частичным их выделением.

В качестве побочных продуктов во время главного брожения образуются альдегиды, высшие спирты и их эфиры, которые оказывают большое влияние на вкус и аромат пива.

Окислительно-восстановительные процессы способствуют выделению в деку и в осадки красящих веществ сусла и значительному обесцвечиванию и осветлению пива.

Дрожжи

В пивоваренном производстве применяются культурные расы дрожжей, т. е. расы, существующие только в производстве и выращенные не в природных условиях, а в условиях специально для них созданных.

По современной классификации пивоваренные дрожжи относятся к классу сумчатых грибов (Ascornycetes), семейству сахаромицетов (Saccharomycetaceae) и представляют собой одноклеточные микроорганизмы, не образующие мицелл и вегетативно размножающиеся почкованием. Половой процесс происходит при слиянии прорастающих спор, причем зиготы начинают нормально почковаться. Споры в половом отношении не дифференцированы.

При неблагоприятных условиях жизнедеятельности у дрожжевых клеток, прекративших почкование, образуется сумка со спорами (4, редко больше); при условиях, благоприятных для вегетативного размножения, споры вновь превращаются в почкующиеся клетки.

Различают дрожжи верхового (Saccharomyces cerevisiae) и низового брожения (Saccharomyces carlsbergensis). Верховое брожение ведется при температуре до 25° С, а низовое при температуре до 10°С; в первом случае основная масса дрожжей во время брожения поднимается на поверхность бродящей жидкости и скопляется здесь в виде довольно плотного слоя; во втором случае дрожжи постепенно опускаются на дно и там образуют плотный осадок. Таким образом, для дрожжей верхового брожения характерно взвешенное в среде состояние, отсюда и произошло их название «пылевидные дрожжи»; наоборот, для дрожжей низового брожения характерно хлопьевидное состояние и им присвоено название «хлопьевидных дрожжей».

Форма и величина дрожжевых клеток тесно связаны с физиологическим состоянием, возрастом и составом среды. При постоянном составе среды величина клеток и их форма становятся типичным признаком отдельных рас; большинство клеток пивоваренных дрожжей имеет длину 9-11 мкм, а ширину 6-8 мкм.

Разница в форме отдельных клеток зависит от изменения состава среды, питания, наличия вредных примесей, в частности тяжелых металлов, изменения температуры и т. п. Значительные изменения являются признаком дегенерации дрожжей.

Здоровые дрожжи всегда наряду с крупными клетками имеют часть мелких, которые в период интенсивного роста не смогли еще достичь величины, присущей взрослым клеткам. Мелкие клетки обычно имеют круглую форму; крупные - овальную и легко изменяют ее в продолговатую. Дрожжи верхового брожения сбраживают рафинозу на 1/3 и соответственно этому не сбраживают мелибиозу. Дрожжи низового брожения сбраживают рафинозу полностью, так как расщепляют ее предварительно на три моносахарида - галактозу, глюкозу и фруктозу.

Химический состав дрожжей

Плотно осевшая густая масса пивных дрожжей содержит до 85% воды. Отделенные от пива, процеженные через частое сито, промытые и сильно отпрессованные дрожжи представляют собой рассыпающуюся при разламывании светло-кремовую массу, содержащую около 70-76% воды и 24-30% сухого вещества. В прессованных дрожжах часть воды находится на поверхности отдельных клеток, а количество воды, содержащееся непосредственно в веществе этих клеток, меньше -63-68%.

Сухие вещества дрожжей состоят из 90% органических веществ, среди которых 54-56% белков и азотистых веществ, 2-3% липидов и липоидов, 24-40% гликогена и других углеводов.

Из неорганических веществ около половины приходится на фосфорную кислоту и около 1/3 - на калий. 30-50% фосфорной кислоты находится в дрожжах в связанном состоянии с органическими веществами, входя в состав таких соединений как ну- клеопротеиды и нуклеотиды - составные части рибонуклеиновых кислот, лецитина и др.

Зола дрожжей состоит из следующих химических веществ:

Состав золы дрожжей	Содержание, %
P2O5	47-73
K2O	2,8-4,0
CaO	0,4-11,3
MgO	3,0-7,4
SiO2	0,28-0,73
SO3	0,09-0,74
Cl	0,10-0,65

Кроме того, в состав золы в небольших количествах входят S, Zn, Mn, Cu, Fe.

Фосфорные соединения в обмене веществ дрожжевых клеток имеют первостепенное значение как при распаде веществ, так и при синтезе. Это видно в процессах брожения: сахар только в том случае подвергается брожению, если он предварительно будет связан эфирной связью с фосфорной кислотой. Обратный процесс образования из глюкозы гликогена протекает через фосфорный эфир глюкозы.

Сера входит в состав белков дрожжей, в которых она существует в форме сульфгидрильной группы (-SH) или дисульфидной (-S-S-), причем SH-группа белка может окисляться до -S-S- группы и вновь восстанавливаться. Наличие такого белка (глюкоманнановый комплекс) установлено в составе внутреннего слоя оболочки клеток дрожжей.

Процесс восстановления -S-S- групп белка, катализируемый специальными ферментными системами, играет большую роль в механизме клеточного деления - почковании.

Содержание в дрожжевых клетках железа и других неорганических элементов обусловлено необходимостью каталитического действия ряда окислительных ферментов (оксидазы, каталазы, пероксидазы).

Из углеводов в дрожжах большое значение имеет гликоген; содержание его может достигать 40% сухой массы, но вообще колеблется в очень широких пределах, в зависимости от состояния дрожжевых клеток и прежде всего - от их питания. В период брожения, особенно вначале, когда в среде содержится большое количество сахаров, дрожжи богаты гликогеном; наоборот, при хранении дрожжей под водой содержание в клетках гликогена резко уменьшается. Старые дрожжевые клетки содержат значительно меньшее количество гликогена, чем молодые клетки.

Гликоген, так же как и крахмал, является некристаллизующимся полисахаридом. Он содержится в тканях животных организмов, а также низших растений и дрожжей. Химическое строение его очень сходно со строением амилопектина, вследствие чего гликоген часто называют животным крахмалом.

Связь отдельных остатков глюкозы в основной цепи происходит по типу «мальтозной связи», т. е. α-1,4, разветвление же осуществляется у C6, т. е. по типу «изомальтозной связи» α-1,6.

Гликоген отличается от амилопектина тем, что он состоит из большего количества разветвлений (рис. 32) и имеет более высокую молекулярную массу. Гликоген представляет собой аморфный порошок белого цвета; в противоположность крахмалу растворяется не только в горячей, но и в холодной воде, образуя опалесцирующий коллоидный раствор; клейстера не образует. Раствор гликогена обладает сильным правым вращением ( +196°). Раствором йода он окрашивается в буро-коричневый, реже красно-бурый цвет; фелингова раствора не восстанавливает. При кислотном гидролизе гликоген разлагается до глюкозы, а при ферментативном гидролизе - до декстринов и мальтозы.

Гумми-вещества, содержащиеся в дрожжах, при гидролизе образуют маннозу и глюкозу. Содержание гумми-веществ, так же как и гликогена, подвержено значительным колебаниям, что обусловлено физиологическим состоянием дрожжевых клеток.

В составе белков дрожжей обнаружены два белка - церевизин и зимоказеин. Церевизин является типичным альбумином, способным коагулировать при высокой температуре и высаливаться сернокислым аммонием. Зимоказеин является типичным фосфопротеидом.

В ядре дрожжевой клетки содержится нуклеопротеид, вернее дезоксирибонуклеопротеид.

Кроме высокомолекулярных азотистых соединений около 10% азотсодержащих веществ в дрожжах находится в виде низкомолекулярных соединений (аминокислот), таких, как лейцин, тирозин, гуанин, ксантин, а также в виде холина, гистамина и никотиновой кислоты.

Дрожжевые белковые вещества содержат настоящих белков около 64%, аминокислот и полипептидов около 10% и фосфорсодержащих белков около 26%.

В значительном количестве в дрожжах содержится глютатион, играющий важную роль в окислительно-восстановительных процессах. В пивных дрожжах глютатиона содержится значительно больше, чем в пекарских: в пивных 0,86-089% на сухое вещество, а в пекарских - 0,65%.

Содержание жира в дрожжах подвергается значительным колебаниям в зависимости от их возраста и питания. В старых дрожжевых клетках количество жира значительно увеличивается и может достигать 10-20%. Из жироподобных веществ в дрожжах найдены лицитин и стерины.

Витамины дрожжей

Из стеринов важное значение имеет эргостерин, являющийся материалом для образования витамина D2 . По количеству эрго- стерина пивные дрожжи превосходят пекарские: в пивных дрожжах содержится 1,2-1,4% эргостерина, а в пекарских только 0,3-0,8%.

В дрожжах содержится большое количество витаминов, причем они находятся в них в благоприятных соотношениях для нормального существования живых клеток, т. е. для процессов роста и размножения.

Дрожжи содержат витамины комплекса В, никотиновую кислоту, пантотеновую кислоту, биотин, инозит, витамин E и др.

Среднее содержание этих витаминов в дрожжах характеризуется данными, приведенными ниже.

Витамины	Содержание, ν на 1 г сухих пивных дрожжей*
Тиамин (витамин B1)	125-150
Рибофлавин (витамин B2)	45-50
Никотиновая кислота (витамин PP)	400-500
Пантотеновая кислота	100-125
Биотин (витамин Н)	1,1-1,5
Пиридоксин (витамин B6)
Холин	3500-4000
Инозит

Гамма (единица массы). ν = 1•10^-9 кг.

По содержанию витамина В пивные дрожжи в 10 раз богаче пекарских.

Некоторые из витаминов входят в состав ферментных систем и принимают непосредственное участие в процессах брожения и дыхания. Так, витамин B₁ является составной частью фермента пируватдекарбоксилазы, расщепляющей пировиноградную кислоту при спиртовом брожении, а витамин B₂ - один из компонентов желтого дыхательного фермента.

В дрожжах также найдены вещества, обладающие гормональными свойствами. Дрожжи оказывают антидиабетическое действие (понижение содержания сахара в крови) при заболевании сахарным диабетом. Из дрожжей выделено вещество - глюкокинин, по своему действию похожее на инсулин. В дрожжах содержатся половые гормоны, в частности фолликулин.

Гормоноподобные вещества совместно с витаминами и ферментами способствуют благоприятному комбинированному каталитическому действию их на регулирование всех жизненных процессов дрожжей.

Питание дрожжей

Внутри клетки из проникших в нее растворенных веществ путем синтеза создаются вещества, накапливаемые в качестве резервных материалов и необходимые для построения новых тканей; все эти вещества находятся в коллоидном состоянии, что препятствует обратному проникновению их наружу; дрожжи приобретают потенциальную энергию, необходимую для построения новых тканей, в том числе и тканей дочерней клетки.

Химический состав дрожжей показывает, что для питания дрожжам необходимы азот, фосфор, калий, магний и углеводы в усвояемой клетками форме.

В качестве азотистого питания дрожжи используют сернокислый и фосфорнокислый аммоний, а также аммиачные соли уксусной, молочной, яблочной и янтарной кислот; нитраты и нитриты предварительно восстанавливаются в аммиак.

Дрожжи способны синтезировать все аминокислоты, входящие в состав их белков, за счет неорганических азотистых веществ, беря углеродную часть промежуточных продуктов распада углеводов, образующихся при дыхании и брожении. Необходимая для этих процессов энергия накапливается в процессе окисления глюкозы.

Таким образом, для синтеза аминокислот (и белков) могут использоваться неорганический азот и органические углеводы. Однако многие дрожжи, в том числе и пивоваренные, усваивая в первую очередь аммонийные соединения, потребляют и азот аминокислот.

Существуют два пути воздействия дрожжей на отдельные аминокислоты - декарбоксилирование и дезаминирование. В результате первой реакции получаются амины, которые дрожжевой клеткой не усваиваются. В результате же дезаминирования отщепляется аммиак, который потребляется дрожжами.

С. А. Коновалов показал, что количество усвояемого азота аминокислот почти полностью соответствует содержанию их в белке дрожжей. Это свидетельствует, что дрожжи должны усваивать не только азот, но также углеродный остаток аминокислот.

Торн установил, что часть аминокислот (в его опытах 2/3 аминокислот гидролизата казеина) усваивается дрожжами непосредственно. Эта возможность непосредственного усваивания аминокислот подтверждается следующими наблюдениями: если в среде содержится аммиак и полная смесь аминокислот, которые могут усваиваться при дезаминировании только под каталитическим действием ферментов, в состав которых входит фосфорный эфир пиридоксина, то расход этого последнего сводится к минимуму. Таким образом, дезаминирования здесь не происходит.

Аминокислотный состав сусла отличается от аминокислотного состава дрожжей, поэтому требуются синтез новых аминокислот и химическое превращение одних аминокислот в другие.

Согласно положению, выдвигаемому И. Я. Веселовым, в процессе синтеза веществ при росте и размножении дрожжей, так же как и в общей схеме реакций спиртового брожения, пировиноградная кислота и ацетальдегид играют основную роль, и синтез новых веществ дрожжей возможен только в условиях превращения сахара в спирт. Синтетические процессы, необходимые дрожжевым клеткам, и спиртовое брожение - взаимосвязанные процессы.

Азотистый обмен в дрожжевых клетках возможен только на базе сбраживания углеводов и осуществляется путем реакции переаминирования. Эта реакция заключается в межмолекулярном переносе аминогруппы с аминокислоты на кетокислоту и имеет важное значение в процессах обмена веществ в живом организме. Схематично она может быть изображена следующим уравнением:

В данном случае пировиноградная кислота, как кетокислота, принимает на себя аминогруппу аминокислоты, участвующей в реакции, например, лейцина:

Кетокислота, вступая на место пировиноградной кислоты в цикле спиртового брожения углеводов, превращается в соответствующий высший спирт и углекислый газ, а образовавшаяся аминокислота, в данном случае α-аланин, потребляется дрожжевой клеткой и участвует в биосинтезе.

Главными углеводами для питания дрожжей служат моно- и дисахариды, расход которых составляет примерно 2% от общего количества сахаров, содержащихся в сусле.

Дрожжевые клетки получают витамины из окружающей среды как в готовом виде, так и в виде основных частей общего комплекса витаминов, чтобы в дальнейшем использовать их для построения отдельных витаминов. М. Н. Мейсль и Е. Н. Одинцова доказали, что дрожжи, получая β-аланин, строят из него внутри клетки пантотеновую кислоту, а из тиазола - витамин B₁.

Дрожжам необходим фосфор, который, как известно, участвует в синтезе нуклеиновых кислот и играет огромную роль в энергетике дрожжевой клетки.

Энергию, необходимую для процесса питания, дрожжевая клетка получает при сбраживании глюкозы. Однако следует отметить, что с энергетической точки зрения анаэробный распад глюкозы малоэкономичен. Большое количество потенциальной энергии остается в спирте, не подвергающемся дальнейшему распаду.

При полном окислении одной грамм-молекулы глюкозы с образованием углекислого газа и воды выделяется около 2846 кДж (680 ккал); при сбраживании грамм-молекулы глюкозы освобождается энергии значительно меньше и дрожжевая клетка может получить лишь около 84 кДж (20 ккал), поэтому она вынуждена покрывать свои энергетические затраты путем сбраживания больших количеств глюкозы.

Размножение дрожжей

Развитие дрожжей, как и других микроорганизмов, зависит от ряда факторов - количества засевного материала, его физиологического состояния, состава питательной среды, температуры и реакции этой среды, механического перемешивания и др.

Размножение дрожжей во время главного брожения проходит через несколько этапов. В начальной фазе дрожжи приспособляются к новой среде. Клетки подготовляются к размножению, накапливают энергию и увеличиваются в своих размерах. Одновременно с этим усиливается процесс дыхания и происходит накопление ферментов. Чем благоприятнее температурные условия и состав среды, тем скорее и легче происходит переход дрожжей в фазу интенсивного роста и размножения, которой присвоено название логарифмической. Размножение их протекает настолько сильно, что дрожжевые клетки не успевают вырасти до нормальной величины, но это способствует увеличению общей поверхности массы дрожжевых клеток и влечет за собой усиление обменных реакций. Расход кислорода сначала быстро увеличивается и, достигнув своего максимума, постепенно снижается. Количество почкующихся и мертвых клеток в этот период приближается к нулю. Окончание этой фазы размножения дрожжевых клеток совпадает с началом брожения.

Прекращение процесса размножения дрожжей характерно для следующей фазы, носящей название максимальной стационарной, и сопровождается выравниванием морфологических и физиологических свойств дрожжевых клеток. В этот период спиртовое брожение протекает наиболее интенсивно.

В последней фазе, в фазе затухания роста, деятельность дрожжевых клеток постепенно снижается вследствие обеднения среды питательными веществами и накопления в ней продуктов метаболизма. Клетки отмирают, и наступает постепенный автолиз и тем быстрее, чем больше среда обедняется продуктами питания.

Температура 25-30°С является оптимальной температурой размножения. Углекислота не благоприятствует размножению дрожжей и даже подавляет этот процесс, а кислород, наоборот, стимулирует его, но потребление кислорода дрожжевыми клетками очень небольшое.

Образующийся при брожении спирт только на самых первых стадиях, когда количество его в среде небольшое, в какой-то мере стимулирует размножение дрожжей, но уже при концентрации 1-2% он замедляет этот процесс, а при концентрации 5% задерживает размножение дрожжей; имеются расы дрожжей, которые при этой концентрации спирта полностью прекращают размножение. Практически в пивоваренном производстве при содержании в бродящем сусле 1,5-2% спирта размножение дрожжей прекращается.

В сусле при брожении в результате накопления углекислого газа и органических кислот устанавливается pH ниже 5, что совпадает с ослаблением процесса размножения дрожжевых клеток. Наиболее интенсивное размножение наблюдается в первые часы задачи дрожжей в сусло, когда pH значительно выше 5. Ван Леер установил следующие соотношения между pH и степенью размножения дрожжей:

pH	3,8	4,6	5,4	6,0	6,8	8,0
Накопление дрожжевых клеток, млн./мл	3,84	4,40	4,48	5,80	4,72	3,90

Наибольшее потребление дрожжами азотистых веществ сусла -происходит в начале главного брожения. Количество их в клетках достигает 40-45% к сухому веществу; дальнейшее усвоение азотистых веществ не превышает нескольких процентов.

Из общего количества сахаров, содержащихся в сусле, на образование дрожжевых клеток при строго анаэробных условиях расходуется только 1-2%. В аэробных условиях размножение дрожжей резко усиливается; процесс анаэробного сбраживания сахара заменяется аэробным процессом дыхания, в результате которого образуется углекислый газ и вода и освобождается во много раз большее количество энергии.

При существующих методах брожения в пивоваренной промышленности количество дрожжевой массы во время главного брожения увеличивается в несколько раз.

Баллинг в своих работах по исследованию брожения пивного сусла установил количественные соотношения основных продуктов брожения - спирта, действительного экстракта и дрожжей. Из 100 весовых частей экстракта в среднем получается (весовых частей): спирта 48,391, углекислоты 46,286, сухого вещества дрожжей 5,323.

Таким, образом, при получении 1 г алкоголя образуется 0,11 г дрожжей.

По данным, приведенным в работе А. 3. Бару, Д. Б. Лившиц, Е. Я. Калашникова, в конце главного брожения количество дрожжевой массы увеличивается в 3,1-7,6 раза.

Автор и Л. Г. Шмидт, определяя количество дрожжей, получаемое в современных условиях брожения, установили, что величина прироста сухого вещества дрожжей при брожении на 1 г спирта в среднем составляет 0,064, а коэффициент размножения дрожжей равняется трем.

Таким образом, величина 0,11, полученная Баллингом, показывает, что прирост дрожжей получается примерно шестикратный.

Размножение дрожжей происходит путем почкования, причем в дочернюю клетку увлекаются все составные части материнской дрожжевой клетки (рис. 33).

Химия спиртового брожения

Суммарно процесс спиртового брожения определяется уравнением Гей-Люссака

C₆H₁₂O₆ = 2С₂Н₅ОН + 2CO₂.

Это уравнение показывает, что из 180 г глюкозы может быть получено 92 г этилового спирта и 88 г углекислого газа. Однако наряду с этими продуктами всегда, правда, в значительно меньших количествах, получается ряд других - глицерин, янтарная кислота, высшие спирты, альдегиды и пр.

Пастер показал, что из 100 г сахарозы образуется 105,4 г инвертного сахара, из которого после сбраживания дрожжами получается 51,1 г этилового спирта, 48,4 г углекислого газа, 3,2 г глицерина, 0,7 г янтарной кислоты и 2 части прочих продуктов. Таким образом, из 180 г глюкозы должно образоваться не 92 г этилового спирта, а меньше - около 87,2 г. Вместе с тем Пастер установил, что накапливаются глицерин и другие продукты, а также происходят затраты сахара на образование вещества дрожжей.

Процесс брожения экзотермический и при распаде одной грамм-молекулы моносахарида освобождается приблизительно 84 кДж (20 ккал) за счет химического процесса и около 17 кДж (4 ккал) за счет теплового эффекта растворения спирта в воде. Это значительно меньше, чем в случае полного окисления того же сахара за счет кислорода воздуха в процессе дыхания.

Сначала брожение рассматривалось как исключительно химический процесс и только со времени Пастера (со второй половины прошлого столетия) его стали связывать с жизнедеятельностью живых организмов; Пастер установил, что микроорганизмы в анаэробных условиях потребляют больше углеводов, чем в аэробных. Он сделал вывод о наличии двух путей получения клетками микроорганизмов энергии за счет распада углеводов: при аэробных условиях путем окисления и при анаэробных- путем брожения, причем в первом случае расщепление углеводов идет в гораздо меньших размерах, чем во втором. Отсюда видно, что Пастер считал брожение физиологическим процессом, тесно связанным с жизнедеятельностью микроорганизмов (в данном случае - дрожжей). Только после выделения из дрожжевых клеток зимазы и осуществления бесклеточного брожения М. М. Манессеиной, Г. Бухнером, Э. Бухнером и А. Н. Лебедевым стало возможным подойти к правильному изучению процессов брожения и связать его химизм с действием ферментов.

С. П. Костычев доказал, что в начале спиртового брожения образуется пировиноградная кислота, которая является источником образования уксусного альдегида и углекислого газа. При образовании пировиноградной кислоты из сахара выделяется свободный водород, при наличии которого образовавшийся уксусный альдегид восстанавливается в этиловый спирт;

C₆H₁₂O₆ = 2CH₃ • CO • COOH + 2H₂;

2CH₃ • CO • COOH = 2CH₃CHO + 2CO₂;

CH₃CHO + 2Н₃ = 2 CH₃CH₂OH.

Л. А. Иванов является автором идеи образования при спиртовом брожении фосфорорганических соединений. При добавлении к бродящей жидкости фосфатов происходит ускорение сбраживания сахара и вместе с тем уменьшается количество неорганического фосфата.

Гарден изучал начальные стадии распада сахара. При этом он установил, что происходит соединение глюкозы с фосфорной кислотой и образование гексозофосфорных эфиров которые в дальнейшем подвергаются расщеплению.

А. Н. Лебедев, а затем Мейергоф установили, что глюкоза расщепляется на глицериновый альдегид и диоксиацетон, а затем уже каждое из этих соединений распадается на пировиноградную кислоту и водород. Эти авторы одновременно подтвердили исключительную роль фосфорной кислоты в первых стадиях брожения. Важная роль фосфорных эфиров сахара в последующих стадиях их превращения была установлена при изучении распада углеводов в мышцах животных Эмбденом.

Фосфорная кислота находится в дрожжах и других живых организмах. Вопреки существовавшему длительный период времени представлению о независимости процессов брожения и дыхания в настоящее время доказано единство этих процессов и особенно ясно это подтверждено работами С. П. Костычева. Промежуточные продукты, найденные в дрожжах при брожении, найдены и в растениях; катализаторами всех промежуточных реакций брожения и дыхания являются одни и те же ферменты.

Другими словами, процесс брожения до образования пировиноградной кислоты протекает так же, как это наблюдается при дыхании. Процесс брожения тесным образом связан с процессом дыхания.

Пировиноградная кислота под действием фермента пируватдекарбоксилазы расщепляется на ацетальдегид и углекислый газ:

Образовавшийся альдегид уксусной кислоты, присоединяя два атома водорода, восстанавливается в этиловый спирт, под каталитическим действием фермента алкогольдегидрогеназы, кофермейтом которой является НАД. Источником водорода является НАД-H2, который образовался на стадии превращения 1,3-дифосфоглицеринового альдегида в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту. Отдавая водород, НАД • H₂ окисляется в НАД, в результате чего он снова приобретает способность окисления новых порций 1,3-дифосфоглицеринового альдегида:

Таким образом, процесс сбраживания молекулы моносахарида в спирт и углекислый газ сопровождается двумя основными категориями реакций: фосфорилирование - дефосфорилирование и окислительно-восстановительные реакции. Реакциям переноса водорода (НАД • H₂→НАД) и фосфора (АДФ→АТФ) отводится исключительно важное значение в процессе брожения и его энергетики.

Для нормального протекания спиртового брожения требуются определенные условия среды; в щелочной среде уксусный альдегид, выделившийся при разложении пировиноградной кислоты, вступает в окислительно-восстановительную реакцию с другой молекулой уксусного альдегида и, присоединяя молекулу воды, образует уксусную кислоту и этиловый спирт; параллельно идет реакция образования глицерина:

2C₆H₁₂O₆ + H₂O = 2СО₂ + CH₃ • CH₂OH + CH₃CООН + 2СН₂ОН • CHOH • CH₂OH

Если же уксусный альдегид связать, например, сернистым натрием, то реакция протекает в сторону образования одного глицерина:

C₆H₁₂O₆ = CH₃CHO + CO₂ + CH₂OH • CHOH • CH₂OH.

На этих примерах показано влияние промежуточных продуктов и реакции среды на течение реакций спиртового брожения. Естественно предположить, что такие промежуточные продукты, как уксусный альдегид и уксусная кислота, могут быть использованы для построения веществ клеток и для обмена веществ.

Другие виды брожения

Кроме спиртового к анаэробным брожениям относятся молочнокислое и маслянокислое. При молочнокислом брожении из одной молекулы гексозы образуются две молекулы молочной кислоты:

C₆H₁₂O₆ = 2СН₃ • CHOH • COOH.

В пивоваренном производстве при инфицировании производственных дрожжей молочнокислыми бактериями (при несоблюдении низких температур главного брожения и дображивания) может наблюдаться молочнокислое брожение, которое в зависимости от степени интенсивности будет оказывать отрицательное Елияние на качество пива.

Маслянокислое брожение протекает по уравнению

C₆H₁₂O₆ = CH₃ • CH₂ • CH₂ • COOH + 2СО₂ + 2Н₂.

При маслянокислом брожении кроме указанных продуктов в значительных количествах образуются побочные продукты - этиловый спирт, молочная и уксусная кислоты. В пивоварении маслянокислые бактерии обнаруживаются сравнительно редко, но в случае их развития сусло приобретает неприятный запах прогорклого масла.

Еще одним видом брожения, которое может наблюдаться в производстве пива, является уксуснокислое брожение, которое в отличие от брожений рассмотренных видов является окислительным.

При уксуснокислом брожении этиловый спирт окисляется в уксусную кислоту.

Процесс протекает в две фазы. Сначала этиловый спирт окисляется в уксусный альдегид, а затем последний окисляется в уксусную кислоту:

2СН₃ • CH₂OH + O₂ = 2СН₃ • CHO + 2Н₂О;

2СН₃ • CHO + O₂ = 2СН₃ • COOH.

Уксуснокислое брожение является причиной порчи пива. Наиболее благоприятной температурой развития уксуснокислых бактерий является температура 25° С, поэтому естественно, что наиболее эффективным методом борьбы с ним, так же как и с развитием других вредных микроорганизмов, является применение очень низких температур хранения пива в подвале. В пиве, направляемом в подвал, уже содержится достаточное количество спирта. Повышение температуры ведет к образованию в пиве мути и пленки уксуснокислых бактерий на поверхности.

Особенно вредно заражение уксуснокислыми бактериями производственных дрожжей. В этом случае уксусное брожение протекает параллельно со спиртовым и приводит к полной порче пива.

Побочные продукты брожения

Главным продуктом спиртового, брожения, содержащимся в пиве, является этиловый спирт, слабый водный раствор которого почти безвкусен и поэтому не может оказывать значительного влияния на вкус пива; значительно более активными в этом отношении являются побочные продукты брожения: алифатические и ароматические спирты, эфиры карбоновых кислот, карбонильные и сернистые соединения, карбоновые кислоты и оксисоединения (альдегиды и кетоны).

Из высших спиртов, а их в сброженных продуктах найдено более 50, основную массу составляют изоамиловый, изобутиловый и пропиловый спирты - примерно 90%.

Механизм образования побочных продуктов брожения имеет большой теоретический и практический интерес, и многочисленные работы, проведенные в этом направлении только в последние три десятилетия, дали результаты, проверенные экспериментально и обладающие наибольшей вероятностью правильного решения этого вопроса.

Основываясь на работах Эрлиха, долгое время считали, что единственным путем образования высших спиртов является дезаминирование аминокислот.

Основной реакцией осуществления такого образования высших спиртов является

R • CHNH₂ • СООН + H₂О → R • CH₂OH + CO₂ + NH₃

Здесь одновременно протекают два процесса: декарбоксилирование и гидролитическое дезаминирование.

Нейбауер и Фромгольц модифицировали эту схему. Они предложили дезаминирование до кетокислоты (через иминокислоту) как первую стадию получения высших спиртов.

Аминокислота сначала дегидрируется в иминокислоту и через реакцию с водой при отщеплении аммиака переходит в соответствующую α-карбоновую кислоту, из которой путем декарбоксилирования образуется альдегид, который затем восстанавливается в соответствующий алкоголь.

Таким образом, из лейцина образуется изоамиловый спирт, содержание которого достигает 70% к общему количеству сивушных масел.

Из изолейцина образуется активный амиловый спирт, из валина - изобутиловый спирт. Таким же путем из тирозина образуется тирозол.

Тирозол обладает горьким вкусом и может придавать пиву ненормально горький вкус.

Аммиак, освобождающийся в результате указанных реакций, потребляется дрожжевыми клетками.

Торн показал, что в некоторых случаях последняя стадия высшего спирта может заканчиваться не реакцией восстановления, а реакцией окисления; в этом случае вместо спирта образуется кислота, например янтарная.

По Женевуа и Лафон, изовалериановая кислота непосредственно превращается в изоамиловый спирт.

Работы этих авторов подтверждают положение, что дрожжи могут синтезировать высшие спирты не только из аминокислот.

Стевенс указывает, что дрожжи способны синтезировать углеродный скелет аминокислот; на этой способности основано производство кормовых, пищевых и пекарских дрожжей. Безазотистые промежуточные соединения - кетокислоты (R • CO • COOH) могут подвергаться переаминированию или декарбоксилированию, превращаясь при этом соответственно в аминокислоты или альдегиды; из последних путем восстановления образуются высшие спирты. Как показал Торн, дрожжи, которые выращиваются в среде, богатой аминокислотами, например в пивном сусле, адсорбируют необходимые аминокислоты путем простой ассимиляции. При отсутствии их в среде дрожжи синтезируют углеродный скелет и, дезаминируя другие аминокислоты, получают азот, необходимый для завершения синтеза.

В пиве содержится β-фенилэтиловый спирт. Дрожжи способны продуцировать фенилаланин из сахаров и простых молекул, вероятно, из фенилпировиноградной кислоты.

Процесс образования высших спиртов рассматривается Эрлихом как самостоятельный, не связанный со спиртовым брожением, вместе с тем этот процесс является эндотермическим и без притока энергии извне осуществляться не может. Образование высших спиртов тесно связано с превращением аминокислот и в анаэробных условиях может протекать только одновременно со спиртовым брожением, являющимся поставщиком необходимой энергии. Действительно, в отсутствие брожения высшие спирты не накапливаются, если даже среда содержит углеводы.

По схеме Эрлиха кроме высшего спирта должен образовываться аммиак. В бродящей среде, однако, ни аммиак, ни аммонийные соли в количествах, которые бы соответствовали указанной схеме, не обнаруживаются. Таким образом, амм