Опанування навичками визначення групи крові
Методика визначення груп крові
Групова приналежність крові за системою АВО визначається за допомогою реакції аглютинації. В даний час використовують три способи визначення груп крові за системою АВО:
1. за стандартними ізогемагглютінірующими сироватками,
2. за стандартними ізогемагглютінірующими сироватками і стандартним еритроцитам (перехресний спосіб),
3. за допомогою моноклональних антитіл (цоліклонов анти-А і анти-В).
При цьому існує наступна загальноприйнята тактика при визначенні групи крові:
1. при плановому дослідженні лікар стаціонару визначає групу крові за стандартними ізогемагглютінірующими сироватками або за допомогою цоліклонов, після чого посилає кров в серологічну лабораторію для перевірки групи перехресним методом.
Група крові вважається певної тільки тоді, коли лабораторія підтвердить дані, отримані лікарем стаціонару. Якщо результати досліджень розходяться між собою, обидва дослідження потрібно повторити.
2. При необхідності визначення групи крові в екстреному порядку (при кровотечі необхідно термінове переливання крові), лікар стаціонару визначає групу сам (в лабораторії повторна перевірка проводиться, але постфактум). У таких випадках також використовуються реакції з ізогемагглютінірующими сироваткамии (або цоліклонамі), але при можливості доцільне застосування перехресного методу.
Визначення груп крові за стандартними ізогемагглютінірующими сироватками.
Цей спосіб в даний час найбільш поширений в клінічній та лабораторній практиці.
Суть методу зводиться до виявлення в випробуваної крові групових антигенів А і В за допомогою стандартних ізогемагглютінірующими сироваток. Для цих цілей використовується реакція аглютинації. Постановку реакції проводять у приміщенні з добрим освітленням при температурі 15-25 ° С.
Необхідне оснащення
1.Стандартние ізогемагглютінірующими сироватки груп О (I), А (II), В (III) і АВ (IV) двох різних серій. Сироватки для визначення груп крові виготовляють у спеціальних серологічних лабораторіях з донорської крові. Сироватки зберігають при температурі 4-8 "С (у холодильнику).
Термін придатності сироватки вказаний на етикетці. Титр сироватки (також зазначається на етикетці) повинен бути не нижче 1: 32 (для сироватки В (III) - не нижче 1: 16/32). Під титром сироватки розуміється те максимальне її розведення, при якому може наступати реакція аглютинації. Сироватка повинна бути прозорою, без ознак гниття. Для зручності стандартні гемагглютінірующімі сироватки різних груп підфарбовують у певний колір: О (I) - безбарвна (сіра), А (II) - синя, В (III) - червона, АВ (IV) - яскраво-жовта. Слід зазначити, що вказані кольори супроводжують всім етикеток на препаратах крові, мають групову приналежність (кров, еритроцити, плазма та ін.)
2. Білі порцелянові або емальовані тарілки або будь-які інші платівки зі смачиваемой поверхнею, марковані 0 (1), А (И), ВЦП), AB (IV).
3. Ізотонічний розчин хлориду натрію.
4. Голки, піпетки, скляні палички (предметні скла).
Техніка проведення реакції
Під відповідними позначеннями групи крові на тарілку (пластинку) наносять стандартні ізогемагглютінірующими сироватки I, II, III груп в об'ємі 0,1 мл (одна велика крапля близько 1 см в діаметрі).
Щоб уникнути помилок наносять дві серії сироваток кожної з груп, так як одна з серій може мати низьку активність і не дати чіткої аглютинації. Всього виходить 6 крапель, які утворюють два ряди по три краплі в наступному порядку зліва направо: О (I), A (II), В (III).
Кров для дослідження беруть з пальця або з вени. Шість крапель досліджуваної крові величиною приблизно з шпилькову голівку 0,01 мл (маленька крапля) послідовно переносять сухою скляною паличкою на пластину в 6 точок, кожну поруч із краплею стандартної сироватки (кількість випробуваної крові повинне бути приблизно в 10 разів менше кількості стандартної сироватки, з якої вона змішується), потім їх обережно за допомогою скляних паличок із закругленими краями перемішують.
Можлива більш проста методика: на тарілку наносять одну велику краплю крові, з якої її забирають куточком предметного скла і переносять в кожну краплю сироватки, акуратно перемішуючи з останньою. При цьому щоразу кров беруть новим куточком скла, стежачи за тим, щоб краплі не зливалися.
Після змішування тарілку періодично погойдують. Аглютинація починається протягом перших 10-30 секунд, проте спостереження слід обов'язково вести до 5 хвилин через можливість більш пізньої аглютинації, наприклад з еритроцитами групи А2 (Н).
У ті краплі, де сталася аглютинація, додають по одній краплі ізотонічного розчину хлориду натрію, після чого оцінюють результат реакції.
Трактування результатів
Реакція аглютинації може бути позитивною або негативною.
При позитивній реакції зазвичай протягом перших 10-30 секунд в суміші з'являються видимі неозброєним поглядом дрібні червоні зернятка (агглютіната), що складаються з склеєних еритроцитів. Дрібні зернятка поступово зливаються в більш великі зерна, а іноді в пластівці неправильної форми.
При цьому сироватка частково або повністю знебарвлюється. При негативній реакції крапля залишається рівномірно забарвленою в червоний колір і в ній не виявляється ніяких зерняток (агглютіната).
Приналежність досліджуваної крові до відповідної групи визначають за наявністю або відсутністю аглютинації при реакції з відповідними сироваткамии.
При цьому слід зазначити, що, якщо сироватки всіх трьох груп дали позитивну реакцію, це вказує на те, що випробувана кров містить обидва агглютиногена - А і В і належить до групи AB (IV).
Однак у таких випадках для виключення неспецифічної реакції аглютинації необхідно провести додаткове контрольне дослідження випробуваної крові зі стандартною ізогемагглютінірующими сироваткою групи AB (IV), що не містить аглютиніни.
Лише відсутність аглютинації в цій краплі при наявності аглютинації в краплях, містять стандартні сироватки груп 0 (1), А (І) і В (Ш), дозволяє вважати реакцію специфічної і віднести досліджувану кров до групи АВ0 (IV).
Слід зазначити, що при наявності в досліджуваній крові слабкого підтипу антигену А2 реакція аглютинації з гемагглютінірующімі сироваткамии груп 0 (1) і В (Ш) починається пізніше (на 3-4 хвилині).
Для точного визначення підтипу антигену А необхідно проведення додаткової реакції з так званим анти-А, реактивом, виготовляються з насіння рослини Dolichos bitforis, що містить лише анти-А, антитіла (проводиться в серологічної лабораторії).
Групи крові - перехресний спосіб
Спосіб найбільш часто використовується в серологічних лабораторіях.
Суть методу полягає у визначенні наявності чи відсутності в досліджуваній крові групових антигенів А і В за допомогою стандартних ізогемагглютінірующими сироваток, а також групових антитіл а і Р за допомогою стандартних еритроцитів. Це дає повну серологічну характеристику крові.
Реакція з стандартними еритроцитами проводиться в такий спосіб.
Необхідне оснащення.
1. Оснащення для реакції зі стандартними еритроцитами відрізняється тим, що для реакції аглютинації необхідні стандартні еритроцити трьох груп крові: 0 (1), А (П), В (Ш).
2. Стандартні еритроцити готують із крові донорів із заздалегідь відомою групою крові, зберігають при 4-8 ° С. Термін придатності 2-3 дні.
Техніка проведення реакції.
1. Кров для дослідження беруть з вени в суху пробірку, центрифугують або залишають у спокої на 20-30 хвилин для поділу на сироватку і еритроцити.
2. На марковану тарілку піпеткою в шість осередків наносять по одній великій краплі сироватки досліджуваної крові з пробірки (0,1 мл), а поряд з ними - по одній маленькій краплі (0,01 мл) стандартних еритроцитів груп 0 (1), А (П), В (Ш) (по дві серії).
3. Подальші заходи проводяться аналогічно методу з використанням стандартних ізогемагглютінірующими сироваток: відповідні краплі змішують скляними паличками, планшет погойдують, спостерігають протягом 5 хв, в краплі з аглютинації додають ізотонічний розчин хлориду натрію, після чого оцінюють результат.
Реакція зі стандартними сироваткамии проводиться описаним вище способом паралельно з реакцією зі стандартними еритроцитами.
Трактування результатів.
При трактуванні результатів оцінюють дані, отримані при обох реакціях зі стандартними ізогемагглютінірующими сироваткамии і стандартними еритроцитами.
Особливістю трактування результатів реакції зі стандартними еритроцитами є те, що еритроцити групи 0 (1) є контрольними (в них немає антигенів, що робить принципово неможливою специфічну реакцію аглютинації з будь сироваткою).
Результат перехресного способу вважається достовірним тільки якщо при оцінці результатів реакції зі стандартними ізогемагглютінірующими сироваткамии і зі стандартними еритроцитами відповіді про групу досліджуваної крові збігаються. Якщо цього не відбувається, обидві реакції слід переробити.
Визначення груп крові моноклональними антитілами
Необхідне оснащення.
Для визначення групи крові використовуються моноклональні антитіла, для одержання яких застосовується гібридомної біотехнологія.
Гібридоми - це клітинний гібрид, утворений шляхом злиття клітини пухлини кісткового мозку (мієломи) з імунним лімфоцитів, які синтезують специфічні моноклональні антитіла. Гібридоми набуває властивостей обох "батьків": здатність до необмеженого росту, характерну для пухлинної клітини, і можливість синтезувати антитіла, властиву імунні лімфоцити.
Розроблені стандартні реагенти - моноклональні антитіла (МКА): цоліклони анти-А і анти-В, які застосовують для визначення агглютіногенов еритроцитів. Цоліклони представляють із себе ли-офілізірованний порошок червоного (анти-А) або синього (анти-В) кольору, який розводять ізотонічним розчином хлористого натрію безпосередньо перед дослідженням.
Техніка проведення реакції.
Цоліклони анти-А і анти-В наносять на білий планшет по одній великій краплі (0,1 мл) під відповідними написами: анти-А або анти-В. Поряд з краплями антитіл наносять по одній маленькій краплі (0,01 мл) досліджуваної крові. Після перемішування складових частин за реакцією аглютинації спостерігають протягом 2-3 хв.
Трактування результатів.
Оцінка результатів дуже проста.
Методика визначення групи крові за допомогою цоліклонов дозволяє відмовитися від послуг донорів, кров яких використовують для приготування стандартних ізогемагглютінірующими сироваток.
Можливі помилки.
Визначення групової приналежності за допомогою реакції аглютинації може супроводжуватися помилками, які ведуть до невірного трактування результатів. Всі помилки можна розділити на три групи:
1. низька якість реагентів,
2. технічні помилки,
3. особливості досліджуваної крові.
Стандартні ізогемагглютінірующими сироватки і стандартні еритроцити можуть мати низькі агглютінабельние властивості, що призводить до невірного тлумачення результатів реакції. Щоб уникнути подібних помилок слід стежити за терміном придатності реагенту, умови зберігання, а також їх зовнішнім виглядом (прозорість сироватки, відсутність плівок, пластівців, запаху гниття і пр.).
Особливості досліджуваної крові
Розвиток неспецифічної панагглютінаціі може бути пов'язано не тільки з низькою температурою, але і з якостями самої крові.
Панагглютінацію при бактеріальному зараженні досліджуваної крові у 1927 р. описав Томсен. Цей феномен (феномен Томсена) характеризується агглютинацией крові з сироваткамии всіх груп і сироваткою власної крові.
Подібне явище неспецифічної аглютинації може спостерігатися і в свіжої крові, але воно зустрічається досить рідко і носить назву панагглютінаціі або аутоагглютінаціі.
Сутність явища полягає в тому, що сироватка при кімнатній температурі дає аглютинацію з усіма еритроцитами, навіть зі своїми власними (аутоагглютінаціі), а еритроцити в той же час дають аглютинацію з усіма сироваткамии, навіть з сироваткою групи AB (IV).
Подібне явище описано при ряді захворювань: хвороби крові, спленомегалії, цирозі печінки, інфекційних захворюваннях і т. д. Описано панагглютінація і у здорових людей, але вкрай рідко (0,07%). Явища панагглютінаціі і аутоагглютінаціі спостерігаються тільки при кімнатній температурі; при температурі, близькій до температури людського тіла, вони зазвичай не виявляються.
Щоб уникнути помилок необхідно не допускати визначення групи крові при температурі нижче 15 ° С. Якщо при визначенні групової приналежності аглютинація спостерігається з сироваткамии груп 0 (1), А (І) і В (Ш), завжди слід проводити реакцію з сироваткою групи AB (IV). І тільки тоді, коли в цій краплині не буде аглютинації, можна виключити панагглютінацію і віднести кров до групи AB0 (IV). За наявності аглютинації з сироваткою AB (IV) необхідно підігріти кров до 37 ° С і вести реакцію при цій температурі.
Панагглютінація і аутоагглютінаціі зникають, якщо визначення групової приналежності проводити при 37 ° С.
При деяких захворюваннях відзначається зниження агглютінабельності агглютіногенов еритроцитів (хронічні інфекційні захворювання, онкологічні захворювання, хвороби крові та ін.) При цьому так само, як і при наявності слабкого антигену А2, слід чітко дотримуватися умов і час реакції.
У всіх випадках нечіткого або сумнівного результату необхідне повторне визначення груп крові за допомогою стандартних сироваток інших серій, а також перехресним способом!