Пояснения по методам лабораторной диагностики вирусных инфекций

Общие свойства вирусов.

Вирусы – микроскопические неклеточные формы жизни, обладающие свойством генетического паразитизма, содержащие один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и размножающиеся путем дезинтеграции. Вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной – вирион и внутриклеточной – вирус. Вирусы человека и животных, в основном, сферической формы, могут быть правильной многогранной формы. Вирусы растений, как правило, палочковидной формы, а вирусы бактерий (бактриофаги) чаще всего имеют форму сперматозоидов. Размеры вирусов колеб­лются от 20 до 300 нм.

В зависимости от размеров вирусы делятся на:

1. Мелкие – от 20 до 60-70 нм (пикорнавирусы, арбовирусы, реовирусы)

2. Средние – 80-150 нм (миксовирусы)

3. Крупные – 150 нм и более (герпесвирусы, оспенные вирусы).

Определенные связи с размером имеет структура и химический состав вируса. Наиболее просто устроены мелкие вирусы, наиболее сложно – крупные. Мелкие вирусы состоят только из нуклеиновой кислоты и белка – это нуклеопротеиды и нуклеокапсиды. Капсид состоит из белковых субъединиц – капсомеров, уложенных компактно, правильными образованиями на поверхности нуклеотида в виде спирали (миксовирусы) или по кубическому типу симметрии (энтеро-, адено-, герпесвирусы). Каждый вирус имеет определенное число капсомеров (адено – 252, полио – 60, герпес – 162 и т.д.). У средних и крупных вирусов, кроме нуклеокапсида, есть внешняя оболочка, содержащая белки, жиры, углеводы, - супрекапсид. Вся эта структура – вирион. В состав вириона входят неорганические ионы.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

I. Экспресс-диагностика – обнаружение вируса или его антигенов в исследуемом материале:

1. Обнаружение внутриклеточных включений (бешенство, герпетическая инфекция, натуральная и ветряная оспа) и элементарных телец (натуральная оспа) с помощью специальных методов окраски и обычной световой микроскопии.

2. РИФ, ИФА, РИА, ЭМ, ИЭМ.

3. Обнаружение нуклеиновой кислоты вируса метод ПЦР.

II. Вирусологический метод – выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация:

1-ый этап – накопление вирусов:

а) в культурах клеток и тканей

б) в куриных или утиных эмбрионах

в) организме чувствительного лабораторного животного

2-ой этап – обнаружение (индикация) вирусов:

а) в культуре клеток: по обнаружению цитоплазматических и внутриядерных включений, по ЦПД вируса, по цветной пробе Солка, по РГА и РГАдс.

б) в курином эмбрионе: по образованию бляшек на поверхности ХАО, по помутнению амниотической жидкости, по РГА.

в) в организме лабораторного животного: по клиническим и патологоанатомическим изменениям тканей и органов.

3-ий этап – идентификация вирусов:

а) РТГА.

б) РН с учетом по: цветной пробе Солка, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса.

в) РИФ, РСК.

III. Серологический метод (серодиагностика) – обнаружение антител к антигенам вирусов в сыворотке крови пациента:

1. РТГА, РСК, ИФА, непрямая РИФ, РИА.

2. РН с живыми лабораторными штаммами вируса.

Пояснения по методам лабораторной диагностики вирусных инфекций.

I. Экспресс-диагностика – обнаружение вируса или его антигенов в исследуемом материале:

1. Обнаружение внутриклеточных включений (бешенство, герпетическая инфекция, натуральная и ветряная оспа) и элементарных телец (натуральная оспа) с помощью специальных методов окраски и обычной световой микроскопии.

a) Элементарные тельца – это отдельные крупные вирионы, имеющие размеры до 200 нм и видимые при особых методах окраски (по Мо­розову, Романовскому-Гимзе) в световой микроскоп: элементарные тельца Пашена при натуральной оспе в содержимом везикул и пустул.

б) В клетках, пораженных некоторыми вирусами, можно наблюдать образование вирусных включений, локализующихся в цитоплазме (тельца Бабеша-Негри при бешенстве, тельца Гварниери при натуральной оспе), или в ядре (при инфекции, вызванной аденовирусами, герпесвирусами). Природа не всех вирус­ных внутриклеточных включений ясна. Тельца Бабеша-Негри при бешенстве, по данным японских ученых, являются местом продукции вирионов, т.е. колониями элементарных частиц. При герпесе включения на ранней стадии формирования представляют собой скопления вирионов. Включения окрашиваются по Романовскому-Гимзе, Туревичу, Муромцеву (при бешенстве).

2. РИФ, ИФА, РИА, ЭМ, ИЭМ.

а) ЭМ (электронная микроскопия) – позволяет обнаружить возбуди­теля в клиническом материале при негативном контрастировании. Этот метод требует достаточно высокой концентрации возбудите­ля в материале (10⁴-10⁵ частиц/мл).

б) Обнаружение антигенов вирусов:

- РИФ (с использованием диагностических люминесцирующих сывороток)

- ИФА (иммуноферментный анализ) – это высокочувствительный, быст­рый метод, технически простой и доступный. Применяется для быст­рой диагностики гепатитов, респираторных инфекций, гастро­энтеритов (ротавирусных инфекций). Чаще всего для обнаружения антигенов вирусов используется сэндвич-вариант постановки ИФА. Для его постановки используют плоскодонный полистирольный иммунологический планшет, на дне лунок которого фиксированны антитела к антигенам вируса (первые антитела). В лунки вносят образец исследуемого материала, инкубируют при определенной температуре, затем промывают лунки специальными буферными растворами. После отмывки вносят вторые антитела, конъюгированные с ферментом (чаще всего – пероксидаза хрена), инкубируют. По окончании инкубации лунки снова тщательно промывают и заполняют субстрат-индикаторной смесью – перекись водорода и тетраметилбензидин (ТМБ) или ортофенилендиамин (ОФД) – и инкубируют при комнатной температуре в темном месте, после чего реакцию необходимо остановить добавлением стоп-реагента (раствор серной или соляной кислоты). Индикатор (хромоген) в присутствии активных радикалов кислорода, образующихся в процессе ферментации перекиси водорода пероксидазой, изменяет свой цвет с бесцветного на синий (ТМБ) или желто-коричневый (ОФД). После остановки реакции при использовании ТМБ цвет раствора изменяется на желтый, а при использовании ОФД становится темнее. Учет реакции ведется в фотоколориметре с вертикальным направлением освещения при длине волны 450 нм для ТМБ и 492 нм для ОФД против контрольных положительной и отрицательной проб.

- РИА (радиоиммунный анализ), разновидность твердофазного иммунологического анализа, когда один из известных компонентов имеет радиоактивную метку. Результаты учитываются с помощью счетчика или авторадиографии, используя рентгеновскую пленку. Для выявления АГ исследуемый материал смешивают со специфической сывороткой, а затем через определенное время вносят гомологичный АГ, меченый радиоактивным изотопом. При этом между анигеном исследуемого материала и меченным антигеном возникает конкуренция за связывание со специфической сывороткой. Если меченый АГ остается свободным, реакция считается положительной, поскольку исследуемый АГ связался с диагностической сывороткой. Такой вариант иммуноанализа называется конкурентным.

- ИЭМ (иммунная электронная микроскопия) – отличается от обычной ЭМ предварительной обработкой исследуемого материала специфическими антителами, мечеными атомом металла. Подобная обработка приводит к тому, что при просмотре электронограммы интересуемые объекты (вирусные частицы) проявляются более четко благодаря большей электронопоглощающей способности металла. Это позволяет выявить возбудителя и одновременно его идентифицировать.

3. Обнаружение нуклеиновой кислоты вируса метод ПЦР.

II. Вирусологический метод – выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация:

1-ый этап – накопление вирусов:

- накопление в культуре клеток и тканей

Культуры тканей стали активно использоваться с 50-х годов, ког­да в практику вошли антибиотики (прекратились бактериальные проросты ткани), были разработаны синтетические питательные среды, а главным стимулом послужило выявление ЦПД у вирусов. С 1954 года стали использовать метод однослойных культур тка­ней. Существует 3 типа тканевых культур:

· первично-трипсинизированные (неперевиваемые)

· полуперевиваемые

· перевиваемые

Первично-трипсинизированные культуры получают из различных тканей: кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, куриных, мышиных, из почек различных эмбрионов, из легких, из роговицы глаза кролика и т. д. Ткань измельчают, обрабатывают трипсином, освобождают от детрита, стандартизуют число клеток, взвешенных в питательной среде с антибиотиками, разливают в пробирки или флаконы. Полуперевиваемые культуры – это культуры из диплоидных клеток, способные вне организма выдерживать 40-50 пассажей благодаря двойному набору хромосом, после чего отмирают. Перевиваемые культуры существуют вне организма очень долго. Они получены из нормальных тканей, из злокачественных, эмбриональных. Перевиваемые линии культур тканей: Нер-2 (злокачественные клетки из опухоли гортани человека), НеLа (злока­чественные клетки из раковой опухоли шейки матки), Детройт-6 (зло­качественные клетки из опухоли мозга), A-1 (клетки амниона человека), МК-2 – из почек обезьяны – всего около 400 видов. Для культур клеток необходимы питательные среды. Наиболее универсальная – 199 среда, содержащая 66 компонентов. Игл установил 28 крайне необходимых компонентов: глютамин, 12 незаменимых аминокислот, 8 витаминов комплекса В, 6 неорганических ионов, углевод, сыворотка. Основу всех сред составляют солевые растворы: Эрла, Хенкса. рН среды должна быть строго определена и постоянна – 7,0-7,4.

- культивирование вирусов в куриных, реже утиных, эмбрионах

Эмбрионы для выделения вирусов применяют с 1930 года. Преимущества: это закрытая полость, свободная от микрофлоры и вирусов. У эмбрионов не образуются антитела, как в ор­ганизме лабораторных животных, они доступны и дешевы. Используются эмбрионы разного возраста (от 5-7-дневного до 11-13-дневных) и разные методы заражения: в амнион, на хорион-аллантоисную оболочку – ХАО, в хорион-аллантоисную полость, в желточный мешок.

- накопление вируса в организме чувствительных лабораторных животных

В основном используются белые мыши разного возраста, обезьяны (для вируса кори). При накоплении вирусов в организме животных можно оценить этапы развития клинической картины заболевания, патоморфологические и патогистологические изменения в органах и тканях.

2-ой этап – обнаружение (индикация) вирусов:

а) В культуре ткани:

¨ Обнаружение внутриклеточных включений, элементарных телец (см. Экспресс-диагностику)

¨ Обнаружение ЦПД разных вирусов в культуре ткани:

При размножении вируса в культуре ткани происходят различные измене­ния, которые в конечном итоге приводят к гибели клетки. Сморщивание клеток, пикноз ядер, скручивание их, образование небольших очагов этих изменений наблюдается при энтеровирусной инфекции, полиовирусы тоже дают очень быстро ЦПД. Вирус может размножаться и не вызывать заметных изменений в клетке, тогда прибегают к окрашиванию монослоя гематоксилин-эозином или другим гистохимическим методом и изучают тонкие изменения в ядрах и цитоплазме и т.д.

¨ РГАдс. – реакция гемадсорбции:

Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Если к культуре клеток, зараженной вирусом с ГА, добавить эритроциты, то они могут адсорбироваться на клетках, пораженных вирусом. Данный феномен наблюдается с вирусами клещевого энцефалита, гриппа, парагриппа, кори, паротита и т. д. Учёт реакции проводится с помощью световой микроскопии.

¨ РГА – реакция гемагглютинации:

Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Вирусы, обладающие ГА, способны вызывать склеивание эритроцитов. В отличие от гемадсорбции, для РГА берется вируссодержащая жидкость (ВСЖ) (культуральная среда, амниотическая или аллантоисная жидкость и т.д.), помещается в лунку планшета и добавляется взвесь эритроцитов (куриных, бараньих, человеческих и др.). При наличии в ВСЖ вируса с ГА происходит агглютинация эритроцитов, и они образуют осадок в виде зонтика (РГА положительная); при отсутствии вируса образуется осадок из эритроцитов в виде пуговки (РГА отрицательная).

¨ Цветная проба Солка:

Самый простой метод индикации вирусов в культуре клеток. Сущность его заключается в визуальной оценке окраски питательной культуральной среды. Большинство питательных сред для культур тканей содержит индикатор – феноловый красный. В нейтральной стерильной среде индикатор имеет красный цвет. В кислой среде феноловый красный становится желтым. Жизнеспособные клетки выделяют в питательную среду кислые продукты своего метаболизма, вызывая изменение цвета индикатора с красного на желтый уже на третьи сутки. При накоплении вируса в культуре клеток он нарушает функционирование клеток вплоть до их гибели. При этом отмечается задержка изменения цвета среды более 6 дней, что и позволяет сделать заключение о присутствии вируса в культуре.

б) В куриных эмбрионах:

¨ Образование бляшек на хорион-аллантоисной оболочке

¨ Помутнение амниотической жидкости.

¨ РГА

в) В организме лабораторного животного:

¨ Оценка клинических проявлений инфекции

¨ Оценка патоморфологических и патогистологических изменений

3-ий этап – идентификация вирусов:

Идентификация вируса производится по инактивации его или его свойств специфическими противовирусными сыворотками. Для этого вируссодержащую жидкость (в РТГА, РН, РСК, ИФА) или культуру инфицированных клеток (в РИФ) инкубируют с диагностическими сыворотками, после чего:

а) РТГА:

¨ добавляется взвесь эритроцитов (курицы, человека, барана и др.). При связывании антителами диагностической сыворотки гемагглютининов вируса агглютинации эритроцитов не происходит (образуется осадок эритроцитов в виде пуговки – РТГА положительная). Если сыворотка не подходит к данному вирусу, эритроциты агглютинируются, образуя осадок в виде зонтика.

б) РН с учетом по:

¨ цветной пробе Солка:

если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не может инфицировать и разрушать клетки культуры, что приводит к пожелтению питательной среды (РН положительная). Если сыворотка не подходит к данному вирусу, он поражает клетки культуры, они погибают, и цвет питательной среды остается красным.

¨ нейтрализации ЦПД:

если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не оказывает ЦПД на клетки культуры (РН положительная). Учет проводят микроскопически.

¨ нейтрализации инфекционной активности вируса:

если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не вызывает заболевание у инфицированного лабораторного животного (РН положительная).

¨ РТГАдс:

если вирус связался с антителами дигностической сыворотки, он не вызывает адсорбции (фиксации) эритроцитов на поверхности культуры клеток (РН положительная). Учет проводят микроскопически.

в) РСК

г) ИФА

можно использовать сэндвич-вариант постановки ИФА (см. экспресс-диагностику, только вместо исследуемого материала используют вируссодержащую жидкость).

д) РИФ

культуру клеток, инфицированных вирусом, обрабатывают дигностической люминесцирующей сывороткой и учитывают результат реакции с помощью люминесцентного микроскопа. Если вирус связывается с антителами диагностической сыворотки, наблюдается свечение клеток (РИФ положительна).

III. Серологический метод (серодиагностика) – обнаружение антител к антигенам вирусов в сыворотке крови пациента:

Для серодиагностики вирусных инфекций используют парные сыворотки, взятые с интервалом 10-14 дней. Диагностически значимым является не менее чем 4-х-кратное нарастание титра AT.

1. РТГА, РСК, ИФА, непрямая РИФ (с антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой), РИА с антигенами вирусов или инактивированными вирусными частицами.

2. РН с живыми лабораторными штаммами вируса с учетом по: цветной пробе Солка, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса.