Экспресс – методы окраски цитологических препаратов

Окраски по Алексееву. Ответ дается уже через 5– 10 минут. Метод Алексеева предусматривает ускоренную обработку цитологических препаратов азурэозиновыми смесями по принципу Романовского с целью получения привычной цитологической картины.Методика приготовления препаратов.

Обработка препаратов может производиться двумя способами:

1. Предметные стекла с высохшими на воздухе препаратами в количестве 3 – 5штук, укладывают на полочку для окраски отпечатками или мазками кверху. Глазной пипеткой на каждый препарат наносят раствор краски Романовского–Гимзы в количестве 5 – 8капель. Краска должна покрыть весь мазок или отпечаток. В таком состоянии препарат оставляют на 60 секунд, в течение которых он фиксируется метанолом, входящим в состав краски, и частично окрашиваются его элементы. Затем к краске на предметных стеклах добавляют 10 – 16 капель нейтральной дистиллированной воды, нагретой до 50 – 60° и покачиванием смешивают краску с водой. Препарат оставляют на l– 2минуты. Затем струей нейтральной дистиллированной воды из колбы-промывалки, не сливая, омывают краску с препарата. Остаток воды сливают и препарат просушиваютфильтровальной бумагой. Окрашенный препарат просматривают под микроскопом сначала с малым увеличением, а при нахождении подозрительных мест переходят на иммерсионный объектив. Остальные мазки оставляют залитыми краской на 3 – 5минут на тот случай, если первый препарат окажется бледно окрашенным. Первым обычно красится самый тонкий из препаратов, так как он быстрее пропитывается и сушится.

Окраска по этому методу тканевых и опухолевых клеток и лейкоцитов почти не отличается от окраски их в препаратах, обрабатываемых обычными цитологическими методами. При этом четко выделяется структура ядер, хорошо видны нуклеолы, зернистость и включения протоплазмы. Эритроциты частично гемолизируются, что облегчает исследование.

2. Приготовляют 0,4% раствор сухой краски Лейшмана в метаноле (метиловый спирт). Для ускорения растворения краски ее можно в закрытом флаконе поместить в водяную баню при 60° на 1 час, помешивая. При охлаждении краску следует профильтровать. Раствор стоек. Препараты укладывают на полочку для окраски, покрывают нетолстым слоем раствора краски Лейшмана (12 – 15 капель на каждый препарат) и оставляют их на 20 – 30 секунд. Затем, не сливая краски Лейшмана со стекла, добавляют к ней раствор краски Романовского–Гимзына нейтральной дистиллированной воде (1,6 капли на 1 мл воды), нагретый до 50 – 60°, в количестве, способном удержаться на стекле. Первый препарат смывают через 2 – 3 минуты, остальные – докрашивают. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и исследуют под микроскопом. Микроскопическая картина при этом способе окраски более яркая, чем при первом. Эритроциты сохраняются. Особенно четко выступают темные нуклеолы на нежно окрашенных ядрах. Дистиллированная вода для разведения краски и смывания ее с препаратов должна иметь рН 6,8 – 7,0.

Окраски по Папаниколау. Метод окрашивания по Папаниколау являетсянаилучшим для гинекологических мазков, так как этот метод полихромный, он позволяет оценить степень созревания цитоплазмы (от сине-зеленого цвета в незрелых клетках до розового в клетках со зрелой цитоплазмой и оранжевого в клетках с ороговением), благодаря влажной фиксации хорошо сохраняются ядра, клеточная мембрана и структура хроматина. Ответ дается через 15– 20 минут.

Необходимые реактивы:

1. Смесь Никифорова.

2. Спирт 95, 90, 80, 70 и 50°.

3. Гематоксилин Гарриса.

4. 0,25%-ный раствор соляной кислоты.

5. Краска оранжевая Г.

6. Краска (ЕА-36).

7. Абсолютный спирт.

8. Ксилол.

9. Канадский бальзам.

Приготовление гематоксилина Гарриса:

1 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта, 20 г калийных квацов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды. Через 24 ч оба раствора соединяют и прибавляют 0,5 г красной или желтой окиси ртути. Раствор нагревают до кипения, остужают и через 24 ч фильтруют.

Приготовление раствора краски оранжевая Г:

К 100 мл 0,5%-ного спиртового раствора оранжевой краски Г добавляют 0,015 г фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Приготовление составной краски (ЕА-36):

45 мл 0,5%-ного спиртового раствора светлой зеленой, 10 мл 0,5%-ного спиртового раствора бисмаркбраун, 45 мл 0,5%-ного спиртового раствора эозина желтоватого (водо- и спирторастворимого), 0,2 г фосфорновольфрамовой кислоты, капля насыщенного водного раствора углекислого лития.

Ход окраски:

Мазки после фиксации проводят последовательно через сосуды, содержащие 80, 70 и 50° спирты и дистиллированную воду. Затем 6 мин гематоксилином Гарриса, осторожно споласкивают дистиллированной водой и погружают (6 раз) в 0,25%-ный раствор соляной кислоты. Далее на 6 минут кладут в сосуд с проточной водопроводной водой и обмывают дистиллированной водой. Затем проводят через 50, 70, 80 и 95° спирты. Обезвоженные таким образом препараты окрашивают в течение 1,5 мин краской оранжевой Г, споласкивают в двух сменах 95° спирта и красят в течение 1,5 мин составной краской (ЕА-36). Мазки отмывают от избытка краски в трех сменах 95° спирта. Далее препараты просветляют проведением через абсолютный спирт, через смесь абсолютного спирта и ксилола в равных объемах и, наконец, через ксилол, после чего заключают в канадский бальзам.

К полихромным методам окраски так же относят метод Шорра (или его модификациюМ. Г. Арсеньевой (1963) и др.), позволяющий дифференцировать клетки на эозинофильные (красные) и базофильные (синие), и монохромные методы (окраска гематоксилином и эозином или гематоксилином и фуксином).Фиксация препарата производилась в метиловом спирте (15 минут). Окрашивание препаратов производилось гематоксилином-эозином. Фиксированные мазки окрашивались водным раствором гематоксилина до получения бледно-фиолетового окрашивания (7 – 10 минут). После промывания проточной водой мазки вновь окрашивались 1%-ным водным раствором эозина в течение 0,5 мин, промывались проточной водой и высушивались.При полихромном методе поверхностные клетки окрашиваются в красный или сине-зеленый цвет, промежуточные и парабазальные – в сине-зеленый, базальные – в темно-синий.

Цитохимические методы основаны на специфической химической цветной реакции между химическим реактивом и определённым компонентом клетки для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ).

При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски (средний цитохимический коэффициент - СЦК).

В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы.Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермента не выявлена (-), в 35 - специфическая окраска была слабой (+) и в 5 - более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах в таком случае составит (60х0)+(35х1)+(5х2)/100=0+35+10/100=0,45 ед.

ШИК-реакция или PAS-реакция (для выявления гликогена).

Реактив - Шифф-периодная кислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК – шифф-йодная кислота). Под влиянием периодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.

Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.

В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.

Обнаружение гликогена методом Мак-Мануса.

Метод Мак-Мануса выявляет вещества углеводной природы (гликозаминогликанов, гликопротеидов, гликогена и др.) в цитологических препаратах. Метод основывается на образовании диальдегидов, которые определяют с помощью реактива Шиффа под воздействием окислителя (йодной кислотой). В клеткахгликоген обнаруживается в виде вишнево-красных гранул.

Методы выявление ферментов:

1. Оксидазы - ферменты, катализирующие окислительные процессы молекулярным кислородом. Среди них особое значение имеет миелопероксидаза (МП).

Миелопероксидаза –является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента повышается по мере созревания клеток. Однако, по мере дифференцировки их в зрелые клетки, активность фермента снижается. В клетках миелопероксидаза участвует в реакциях разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема–Кнолля или его модификаций. Реакция используется главным образом с целью диагностики острых лейкозов.

2. Фосфатазы входят в состав гидролаз. Эти ферменты широко распространены в клетках человека и животных. Они участвуют в обменных процессах с жирами, полисахаридами и нуклеопротеидами. К ним относятся такие ферменты как кислая фосфатаза и щелочная фосфатазы.

Кислая фосфатаза (КФ) – катализирует освобождение фосфата из спиртовых или фенольных моноэфиров при кислой рН среды. Кислые фосфатазы локализованы в лизосомах и цитохимически выявляются благодаря образованию окрашенных участков красного цвета в местах гидролиза субстрата. В качестве субстрата могут быть использованы нафтол-AS-фосфат, а-нафтилфосфат натрия, нафтол-А8-О-фосфат и др. Кислая фосфатаза присутствует в большинстве клеток крови и костного мозга. В гранулоцитах, моноцитах, эозинофилах и базофилах она выявляется, начиная с незрелых клеток этих рядов, где ее активность наиболее высокая.

Щелочная фосфатаза (ЩФ) –это фермент, которыйспособен освобождать фосфат, катализируя отщепление фосфатных групп из фосфомоноэфиров в щелочной среде и принимает участие в обмене липидов и нуклеиновых кислот. Содержится исключительно в зрелых нейтрофилах. В периферической крови активность щелочной фосфатазы значительно выше, чем в клетках костного мозга. Фермент выявляется в виде желто-коричневых гранул в цитоплазме.

3.Неспецифическиеэстеразы (НЭ) также относятся к гидролазам. Эти ферменты способны гидролизовать простые эфиры N-свободных спиртов жирных кислот. Это весьма неоднородная группа энзимов, названия которых обусловлены субстратом, который они гидролизуют. Получено более 9 изоферментов НЭ. Фракции 1, 2, 7, 8, 9 выявляются при использовании нафтол-АБ-О-хлорацетата и представляют активность хлорацетатэстеразы, которая присутствует в гранулоцитах. Фракции 3, 4, 5, 6 взаимодействуют с эфирами α-нафтилацетата и представляют собою НЭ, выявляемые в моноцитах, плазматических клетках и тромбоцитах. Наибольший интерес для гематологов представляют хлорацетатэстераза, α-нафтилацетатэстераза, кислая α-нафтилацетатэстераза. Неспецифическиеэстеразы являются лизосомальными ферментами.

α-Нафтилацетатэстераза(αНАЭ) обнаруживается во всех миелоидных клетках, но наибольшая ее активность определяется в моноцитах. В клетках эритроидного ряда в норме она не определяется.

Кислаянафтилацетатэстераза– это фермент, локализующийся в лизосомальных гранулах. Его активность выявляется в реакции с α-нафтилацетатом в кислой среде при рН 5,8. Она характерна для Т-хелперов. Кроме того, она выявляется в клетках моноцитарного ряда.

Хлорацетатэстеразу (ХАЭ) называют гранулоцитарной. Как и миелопероксидаза, она является маркером нейтрофилов. Активность фермента выявляется в виде гранул синего цвета.

Сдвоенную реакцию на ХАЭ и αНАЭ проводят последовательно на одном мазке. Это позволяет разделить клетки гранулоцитарной и моноцитарной линий, что имеет значение при диагностике миеломоноцитарного лейкоза.

Реакция Браше.Метод служит для выявления РНК. Используется реактив из смеси двух красителей:метилового зелёного и пиронина.Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет.Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет.Другие структуры ядра (помимо ядрышек) - зелёные.

Реакция Фёльгена.Основной реактив - фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа).ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет.

Цитохимическое исследование липидов.Липиды локализуются в цитоплазме клеток главным образом в мембранах органелл и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах. Играют важную роль в проницаемости мембран. Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черныйсудан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Красители. Классификация красителей.

2. Тинкториальные свойства клеточных структур. Метахромазия.

3. Группа основных или ядерных красителей, понятие «базофилии».

4. Кислые красители – цитоплазматические, понятие «ацидофилии».

5. Нейтральные красители. Индифферентные красители.

6. Приготовление красителей.

7. Оценка качества цитологического препарата. Артефакты.

8. Стандартная световая микроскопия фиксированных, окрашенных мазков. Разрешающая способность светового микроскопа.

9. Распространенные методы окраски цитологических препаратов.

10. Окраска гематоксилин-эозиновыми красителями. Виды гематоксилиновых красителей.

11. Окраска азур-эозиновыми красителями.