Непредвиденные преграды на пути восстановления вымерших видов

Разрабатывая технологию искусственного оплодотворения пиренейских козерогов, группа ученых, занимающаяся клонированием букардо, обнаружила, что эмбрионы букардо (в случае, если ученым удастся зайти так далеко в своем эксперименте) смогут развиться в организмах суррогатных матерей – гибридов домашней козы и пиренейского козерога, – но чистокровные домашние козы вряд ли для этого подойдут. Ученые обнаружили преграду для межвидового клонирования, возникшую в ходе эволюционного расхождения этих двух видов.

С точки зрения науки возрождения вымерших видов важно, что вероятность появления подобных преград увеличивается вместе с эволюционной дистанцией. Для вымерших видов, не имеющих близких эволюционных родственников, может не найтись подходящих суррогатных матерей. Однако эксперимент с козерогами показал, что такие преграды могут существовать и между видами, находящимися в близком родстве. Редактирование генома способно даже стать причиной появления таких барьеров, если, к примеру, будут прерваны важные взаимодействия между эмбрионом и вынашивающей его самкой. Таким образом, даже те проекты по возрождению вымерших видов, в которых задействованы минимально отредактированные геномы, могут завершиться неудачей из-за непредвиденной несовместимости эмбриона и его суррогатной матери.

Некоторые виды несовместимости могут проявить себя еще до стадии имплантации. К примеру, если яйцеклетка несовместима с соматической клеткой, ядро которой в нее перенесли, то ни одна такая яйцеклетка не превратится в эмбрион, даже если соматические клетки были правильно и полностью перепрограммированы. Подобная проблема может возникнуть, к примеру, когда ядерный геном соматической клетки несовместим с митохондриальным геномом яйцеклетки.

Митохондрии – это органеллы, живущие в цитоплазме клетки, и они не входят в состав ядерного генома. Все митохондрии, расположенные во всех клетках организма, происходят от митохондрии яйцеклетки, из которой развился организм. У митохондрии есть свой собственный геном, кодирующий некоторые белки, необходимые для клеточного дыхания (процесса, в ходе которого клетка перерабатывает кислород и простые углеводы в энергию). Другие белки, участвующие в клеточном дыхании, вырабатываются генами, расположенными в ядре. В случае несовместимости митохондриального и ядерного геномов эти гены также могут оказаться несовместимыми. Если же они не будут работать сообща, обеспечивая клеточное дыхание, это может привести к нарушениям обмена веществ, неврологическим заболеваниям и даже смерти. До сих пор все проекты межвидового клонирования включали только перенос ядерной ДНК, но не митохондриальной.

Исследователи из лаборатории Дэвида Рэнда в Брауновском университете продемонстрировали, как несоответствие ядерной и митохондриальной ДНК может привести к появлению необычных фенотипов у в остальном обычных межвидовых гибридов. Ученые из лаборатории Рэнда создали дрозофил, обладающих ядерной ДНК Drosophila melanogaster и митохондриальной ДНК Drosophila simulans – двух видов мушек, разошедшихся около 5,4 миллиона лет назад. Получившиеся в результате мушки с не соответствующими друг другу геномами имели на спинах ворсинки, были в два раза меньше, чем нормальные мушки, страдали пороками развития, плохо размножались и, чего и стоит ожидать при недостаточной выработке энергии, уставали быстрее мушек с совпадающими геномами.

Несоответствие митохондриального и ядерного геномов может стать проблемой для восстановления вымерших видов, но есть и очевидное решение. Если эти митохондрии не подходят, почему не заменить их митохондриями, соответствующими ядерному геному? Или не отредактировать митохондриальный геном, заменив проблемные участки? Предположительно, это можно осуществить теми же методами редактирования, которые мы собираемся использовать для изменения нуклеотидной последовательности ядерного генома. Ни один из этих подходов нельзя назвать простым и ни один пока нельзя осуществить на практике. Однако в теории они оба реализуемы.

Проблемы мамонтов

Теперь, когда я познакомила вас с некоторыми препятствиями, ожидающими нас на стадиях клонирования и внутриутробного развития клонированного животного, давайте вернемся к примеру мамонта. Как я рассказала в предыдущей главе, сейчас у нас имеется технология, позволяющая отредактировать геном слона таким образом, чтобы он содержал по меньшей мере несколько генов мамонта. Допустим, что мы отредактировали геном либо стволовой клетки, либо клетки, которую можно перепрограммировать, превратив в стволовую. Тогда пора переходить к следующему этапу: созданию животного с отредактированным геномом и (будем надеяться) признаками, которые мы собирались возродить.

Чтобы этот этап завершился, клетка должна превратиться в эмбрион, и поскольку мы не можем вырастить слона в лаборатории, этот эмбрион нужно будет пересадить суррогатной матери. Далее зародыш должен имплантироваться в стенку матки и тем самым положить начало беременности. Эта беременность, в свою очередь, должна протекать благополучно и завершиться рождением здорового детеныша, с геномом, содержащим несколько тщательно отобранных и с большим трудом встроенных туда генов мамонта.

Простейший способ превратить отредактированную клетку в эмбрион – это использовать яйцеклетку. Мы знаем, что яйцеклетки содержат белки, активирующие, то есть перезагружающие, дифференцированные клетки, снова превращая их в эмбриональные стволовые. Неудивительно, но для активации отредактированной клетки слона лучше всего подходит слоновья яйцеклетка. Добыть ее не так уж просто. Во время овуляции организм индийской слонихи вырабатывает всего одну яйцеклетку. Эта яйцеклетка проходит по репродуктивной системе в матку, которая, предсказуемо, имеет слоновьи размеры. У небеременной слонихи овуляция происходит один раз в 2–3 месяца. Учитывая малую эффективность ядерного переноса, разумно будет предположить, что, собирая одну яйцеклетку раз в 2 месяца (если нам удастся найти эту яйцеклетку в половых путях слонихи), мы не получим достаточного их количества. Нам понадобятся сотни, если не тысячи, слоновьих яйцеклеток, чтобы наш метод сработал. Откровенно говоря, это кажется нечестным. Слоны изо всех сил стараются размножаться, чтобы поддерживать здоровье своих популяций. Последнее, что им нужно, – это чтобы мы рыскали вокруг их яичников и воровали их драгоценные созревшие яйцеклетки. На самом деле если бы это был единственный способ добыть слоновьи яйцеклетки, я бы посчитала, что исследования для проекта восстановления мамонта нужно немедленно прекратить.

К счастью, похоже, есть и другой путь. В 1998 году исследователи из Университета Пердью и Института репродуктивной медицины при медицинском центре «Методист» в Индианаполисе создали мышей, организмы которых способны вырабатывать слоновьи яйцеклетки. Руководитель исследования, доктор Джон Кристер, искал способ увеличить скорость размножения видов, находящихся под угрозой исчезновения, и надеялся, что хорошим началом будет убедить лабораторных мышей выращивать слоновьи яйцеклетки. Ученые из его группы пересадили лабораторным мышам участки ткани яичников (ткань, в которой содержатся незрелые яйцеклетки), взятые у трех трупов южноафриканских слоних. У нескольких из этих мышей образовались фолликулы, вырабатывающие яйцеклетки, и спустя 10 недель один из этих фолликулов породил слегка деформированную слоновью яйцеклетку. Кристер с коллегами не пытались оплодотворять эту яйцеклетку спермой слона, так что нельзя сказать, развился бы из нее жизнеспособный эмбрион или нет. Но это хороший старт.

Будем надеяться, что ученым удастся изобрести эффективный способ получать большое количество слоновьих яйцеклеток, не подвергая никаких слонов риску. Затем мы смогли бы собрать тонну (возможно, буквально) слоновьих яйцеклеток, удалить из них ядра и вставить на их место другие, содержащие отредактированные нами геномы. Затем мы сможем расслабиться, позволив перепрограммирующей магии яйцеклеток вступить в дело. Если этот этап пройдет благополучно и в результате мы получим жизнеспособные, развивающиеся эмбрионы слонов (со слегка модифицированными геномами), мы перенесем эти эмбрионы в матки взрослых слоних, где они смогут развиться в новорожденных слонят (со слегка модифицированными геномами).

Вход в матку слонихи прикрыт плевой, называемой гименом. У слоних гимен остается на месте в течение всей беременности, разрывается во время родов, а затем вырастает заново во время подготовки организма к следующим родам. Чтобы у суррогатной матери-слонихи развилась здоровая беременность, эмбрион и тот инструмент, которым его доставят в матку, должны пройти сквозь единственное отверстие в гимене – четырехмиллиметровое окошко, предназначенное только для проникновения спермы, – не повредив плеву и не поставив тем самым беременность под угрозу.

Предположим, что это возможно. Предположим также, что беременность установилась и эмбрион начал свое развитие. Следующим шагом будет терпеливое ожидание. Обычно беременность у индийских слонов длится от 18 до 22 месяцев. Будем надеяться, что в этот период между эмбрионом и суррогатной матерью не возникнет никаких проблем совместимости. Будем надеяться, что генетическое строение матери не повлияет на экспрессию генов, которые мы изменили. Понадеемся также, что ее характер питания, гормоны и уровень стресса не изменят среду, в которой развивается эмбрион, и не повлияют на экспрессию генов, которые мы изменили. Наконец, понадеемся, что роды пройдут успешно как для суррогатной матери, так и для новорожденного.

Размер имеет значение

Планируя эксперимент по межвидовому клонированию, важно учитывать физические различия между двумя видами, вовлеченными в эксперимент. Мамонты, жившие в эпоху позднего плейстоцена, существенно отличались друг от друга по величине. Самые крупные из них имели примерно такие же размеры, как крупные африканские слоны, а самые мелкие были такими же, как средний индийский слон, или даже меньше. Мы не знаем, были ли эти отклонения в размерах генетически обусловлены или они просто отражали различия в количестве и качестве доступной мамонтам пищи. В любом случае, эти отличия, вероятно, будет важно учесть при выборе суррогатной матери. Интересно, что обе найденные нами мумии мамонтят в высоту имели около 90 сантиметров – это примерно соответствует размеру новорождённого индийского слоненка. Следовательно, самой подходящей суррогатной матерью для мамонтенка стала бы представительница вида слонов, находящегося в наиболее близком родстве с мамонтами.

Различия в размерах могут привести к проблемам во время беременности и при родах. Представьте, к примеру, что самку чихуахуа оплодотворили спермой немецкого дога. Эмбрионы могут начать развиваться, заполняя все доступное им пространство, но как только свободное место закончится, их развитие прекратится. В конечном итоге могут умереть как эмбрионы, так и мать или даже все вместе. При попытке родить естественным образом мать почти наверняка будет ужасно мучиться. Возвращаясь к возрождению вымерших видов: что случится, если очень крупный зародыш тура будет развиваться в матке домашней коровы, имеющей куда меньшие размеры? Или если дюгонь попытается выносить стеллерову корову? При выборе суррогатной матери определенно нужно учитывать различия в размерах между представителями разных видов, даже когда речь идет о близких родственниках.

Одно из решений заключается в том, чтобы создать миниатюрные версии некоторых исчезнувших видов. Мы можем определить, какие гены или наборы генов наиболее важны для определения размеров тела, и немного изменить их путем редактирования генома. Полезная информация о том, какие гены должны стать нашей целью, может обнаружиться в ходе генетического анализа популяции мамонтов, живших на Островах Чаннел в Калифорнии. Эти так называемые карликовые мамонты вырастали только до 2 метров в холке и, вероятно, весили менее 800 килограммов, в то время как мамонты с материка достигали 4 метров в высоту и весили более 9 тысяч килограммов. Но у этой идеи есть один недостаток. Маленькие мамонты из-за своего размера могут оказаться не способны воспроизвести экологические взаимодействия, имевшие место между «нормальными» мамонтами и экосистемами, в которых они жили. Следовательно, возродив карликовых мамонтов, мы можем не добиться экологической цели, которую преследует восстановление этого вида.

Еще одно возможное решение состоит в том, чтобы полностью отказаться от суррогатных матерей и использовать вместо этого искусственные матки. Здесь я представляю себе нечто наподобие тех искусственных маток, в которых выращивали детей в книге «О дивный новый мир» Олдоса Хаксли. Или, еще лучше, гигантских резервуаров, наполненных питательными веществами, в которых на планете Камино выращивали клонированных людей для борьбы на стороне добра в фильме «Звездные войны: Эпизод 2». В варианте с искусственными матками эмбрионы будут развиваться до конца своего срока в полностью искусственной среде, – эта концепция известна как эктогенез. Современной медицине еще далеко до создания функциональных искусственных маток и успешного эктогенеза, однако не стоит сомневаться, что новые разработки в этой области существенно повлияют на неонатальную и перинатальную медицину. Кроме того, используя искусственные матки, мы полностью избежим любых страданий, которые причиняет животным суррогатное материнство. Однако этот вариант предполагает, что пребывание в условиях настоящей матки не критично для нормального развития млекопитающего. Так ли это, наука пока не знает.

Клонирование (не) для птиц

Хотя до сих пор в центре моего внимания было возрождение мамонта, сейчас у меня есть прекрасная возможность переключиться на другой проект, в котором я принимаю участие, – речь идет о воскрешении странствующего голубя. Ранее я упоминала, что некоторые виды не будут клонированы методом ядерного переноса. К ним относится и странствующий голубь.

Поскольку птицы развиваются скорее снаружи, нежели внутри тела суррогатной матери, кажется, что они очень хорошо подходят для клонирования путем ядерного переноса. Но среди перечисленных мной животных, клонированных с помощью этого метода, не было ни одной птицы. Почему же это так?

Простой ответ заключается в том, что птиц нельзя клонировать таким способом.

Птица начинает свой долгий путь к превращению из неоплодотворенной яйцеклетки (ооцита), находящейся в яичнике птицы. На первом этапе яйцеклетка выходит в яйцевод. На пути через эту очень длинную, закрученную спиралью трубку яйцеклетка встречает сперматозоид и происходит оплодотворение. Затем, в течение следующих суток или около того, оплодотворенная яйцеклетка медленно спускается по яйцеводу, полному неожиданных поворотов и крутых спиралей. По мере того как она катится по этому пути, ее постепенно покрывают слои альбумина и структурных волокон – это вещество известно нам как яичный белок. Во время своего продвижения оплодотворенная яйцеклетка начинает делиться. Пока она кувыркается по яйцеводу, структурные волокна оплетают желток, надежно закрепляя его внутри белка. Ближе к концу яйцевода, сразу перед тем, как яйцо будет отложено, вокруг развивающегося зародыша формируется последняя, твердая оболочка (скорлупа). К завершению путешествия из материнского яичника в окружающий мир эмбрион состоит примерно из 20 тысяч клеток. Далее они начнут дифференцироваться в различные типы тканей.

В какой точке этого процесса можно осуществить ядерный перенос? При работе с млекопитающими у самки берут яйцеклетку, ядро которой будет удалено и заменено другим, когда клетка уже созрела, но еще не была оплодотворена. Именно на этой стадии яйцеклетка готова перепрограммировать ядро соматической клетки. Но добыть яйцеклетку в нужный момент оказалось в высшей степени сложно. Половые пути птиц очень длинные и извилистые, и добыть ее до оплодотворения крайне трудно. Если же мы подождем, пока птица отложит яйцо, клетки эмбриона уже начнут дифференцироваться и он, удерживаемый на своем месте внутри яйца множеством слоев переплетенных волокон, будет слишком большим, чтобы мы смогли его изъять. Но даже если нам удастся извлечь эмбрион и заменить его на другой, не разрушив при этом яйцо, эмбрион-подменыш должен находиться на той же стадии развития, что и собственный эмбрион яйца. Вырастить эмбрион до такой стадии в лабораторных условиях также оказалось чрезвычайно сложной задачей. Следовательно, пока что клонирование птиц как будто в принципе невозможно.

К счастью, существует и другой путь. Когда птица откладывает яйцо, эмбрион все еще находится на очень ранней стадии развития. Первичные половые клетки (или гоноциты) – клетки, которые в дальнейшем превратятся либо в сперматозоиды, либо в яйцеклетки эмбриона, – уже сформировались, но еще не переместились в репродуктивные органы, поскольку их пока не существует. Примерно через сутки после того, как птица откладывает яйцо, первичные половые клетки мигрируют по кровотоку эмбриона в репродуктивные органы (которые уже начинают развиваться), где и остаются до тех пор, пока не превратятся в зрелые сперматозоиды или яйцеклетки.

Первичные половые клетки – это ключ к работе с генами птиц. Гоноциты можно вырастить в лабораторной посуде, что позволяет нам редактировать их геномы. Эти клетки также имеют очень малые размеры, а значит, их можно ввести в яйцо во время того второго суточного интервала, когда оно уже находится снаружи, а первичные половые клетки прокладывают путь к развивающимся репродуктивным органам птицы. Таким образом, введенные в яйцо отредактированные гоноциты попадут в репродуктивные органы эмбриона вместе с его собственными гоноцитами. Когда эти клетки созреют, те из них, что были отредактированы, поучаствуют в формировании следующего поколения птиц.

Цыпленок, вылупившийся из яйца, в которое мы ввели генетически модифицированные первичные половые клетки, сам по себе не будет иметь генетических изменений. Но клетки с отредактированными геномами останутся в его репродуктивных органах. Первая экспрессия измененных генов произойдет, когда этот цыпленок вырастет и на свет появятся его собственные цыплята.

Давайте рассмотрим, как тот же процесс будет работать в случае возрождения странствующего голубя. Его ближайший живой родственник – полосатохвостый голубь. Цель нашего проекта – создать полосатохвостых голубей, которые будут выглядеть и вести себя как странствующие голуби, хотя эти эксперименты еще не начались. Чтобы добиться этого, мы выделим первичные половые клетки полосатохвостого голубя и вырастим их культуру в лаборатории. Затем мы отредактируем геномы этих клеток с помощью технологий, описанных несколькими главами ранее, по необходимости заменив гены полосатохвостого голубя на соответствующие им версии генов странствующего голубя. Затем мы введем эти отредактированные клетки в яйца полосатохвостого голубя в точности в нужный нам период развития. Вылупившиеся цыплята будут генетически чистыми полосатохвостыми голубями, за исключением некоторого числа их половых клеток (сперматозоидов или яйцеклеток), содержащих ДНК странствующего голубя. Потомство, получившееся из этих отредактированных половых клеток, будет иметь в своих клетках участки ДНК странствующего голубя.