Фиксированных препаратов из клещей

118. Необходимое оборудование: микроскоп со светлопольным конденсором и препаратоводителем, осветитель ОИ-19 или другой системы, предметные стекла толщиной не более 1,4-1,5 мм, острые ножницы, глазной пинцет. Оптимальное увеличение - x600-x750 в системе с масляной иммерсией (объективы: x90-x100).

119. Для приготовления препарата из взрослого клеща, удерживая его пинцетом, отрезают задний край тела исследуемой особи. Срез промакивают фильтровальной бумагой. Держа клеща вертикально, проводят срезом по поверхности предметного стекла, делая мазки по 2,5-3,0 см. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют. Наиболее простой способ - фиксация в пламени спиртовки или газовой горелки. Для этого предметное стекло (мазками вверх) трижды проводят над пламенем так, чтобы его прямое воздействие не превышало 1-2 сек. После этого препарат можно длительное время хранить в сухом месте при комнатной температуре.

120. Окраску проводят общепринятым способом по Романовскому - Гимза (40-60 мин. в 5% водном растворе Гимза с последующим ополаскиванием и высушиванием). Затем препарат необходимо докрасить кристаллическим фиолетовым в течение 10-30 мин., после этого слегка ополоснуть под тонкой струйкой воды, быстро удалить оставшиеся капли спринцовкой (фильтровальную бумагу использовать для этого не рекомендуется) и высушить.

121. Состав краски: 80 мл 2% раствора оксалата аммония (калия или натрия); 20 мл метилового или этилового спирта; 2 г кристаллического фиолетового. Краситель растворяют в спирте и смешивают с раствором оксалата. Полученную краску можно хранить при комнатной температуре не менее года и использовать многократно. Так как выцветание препарата начинается достаточно быстро, его просмотр должен быть проведен не позже чем через 2-3 недели после приготовления. До этого препараты нужно хранить в темноте. В случае выцветания препарата, возможно его повторное окрашивание кристаллическим фиолетовым указанным выше способом.

122. При просмотре препарата поиск боррелий ведут на тонких (не более одного слоя клеток) участках мазка с таким расчетом, чтобы в каждом из двух мазков просмотреть не менее 100-150 полей зрения. Выполнение этого объема работы с высокой степенью вероятности гарантирует обнаружение боррелий в препарате из инфицированного клеща.

123. Для приготовления препарата из нимфы ее раздавливают любым тонким инструментом с зашлифованным концом и фрагментами клеща проводят по предметному стеклу. Обычно таким путем удается сделать лишь один мазок, который обрабатывают и исследуют, как описано выше.

124. Обнаружение антигенов боррелий .Тесты для выявления антигенов боррелий в различном клиническом материале пока не нашли широкого применения в диагностической практике и используются только в исследовательских целях. Исключение составляет коммерческий тест «Lyme Urine Antigen Test» (LUAT, США), который применяется для лабораторной диагностики боррелиозов в Северной Америке. Недостатком данного теста является его низкая стандартизованность.

125. Молекулярные методы диагностики.Достижения науки открыли возможность использования в медицине методов молекулярного тестирования: автоматическая экстракция нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция в режиме «реального времени», автоматизированная детекция ДНК-мишени.

126. Полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР) позволяет с высокой степенью специфичности и чувствительности осуществлять детекцию ДНК или РНК микроорганизмов. Трудности культивирования боррелий и низкая концентрация возбудителя в клиническом материале определяют потенциальные преимущества ПЦР в качестве метода экспресс-диагностики Лайм-боррелиозов.

127. Использование ПЦР для исследования цереброспинальной жидкости больных нейроборрелиозом показало, что этот метод превосходит по чувствительности культуральный, но уступает серологическому тестированию. Чувствительность ПЦР-диагностики составляет при раннем боррелиозе 25–30%, при хроническом нейроборрелиозе – 10%.

128. Главной проблемой ПЦР-диагностики клещевых боррелиозов является большое количество ложноотрицательных результатов. В отличие от инфицированных клещей, в которых количество боррелий может достигать 4 500, клинический материал (цереброспинальная или внутрисуставная жидкость, синовиальная ткань, кровь и моча) содержит ничтожно малое их количество, что недостаточно для индикации методом ПЦР.

129. Исследование возможности ПЦР-диагностики при боррелиозах сосредоточено на тех стадиях заболевания, где серологический метод диагностики недостаточно информативен, прежде всего, на раннем боррелиозе и нейроборрелиозе.

130. Серологические методы диагностики.Определение антител к B.burgdorferi в сыворотке крови, цереброспинальной и внутрисуставной жидкостях в настоящее время является основным методом диагностики клещевых боррелиозов, особенно у больных с диссеминированной или хронической стадиями инфекции. Для этой цели используются реакция непрямой иммунофлюоресценции, РСК, РПГА, ИФА или ELISA, иммунный блоттинг.

131. Специфические иммуноглобулины к антигенам боррелий обычно начинают определяться у пациентов на 3–6-й неделе после начала инфекции. Изучение развития иммунного ответа у нелеченных больных Лайм-боррелиозом показало, что иммуноглобулины класса M начинают обнаруживаться на 2–4-й неделе после начала инфекции. Образование специфических IgM у инфицированных лиц обычно предшествует появлению иммуноглобулинов класса G. Однако у некоторых больных синтез IgM может задерживаться или отсутствовать вообще. На ранней стадии боррелиозной инфекции оба класса специфических иммуноглобулинов синтезируются в основном против ограниченного числа антигенов.

132. При раннем боррелиозе с целью установления сероконверсии важно исследовать парные сыворотки, полученные от пациентов с интервалом в 20–30 дней. Специфические иммуноглобулины класса M детектируются у 70–90% пациентов с боррелиозом при I стадии, у 30–80% – при II стадии и у 5–48% – при III стадии.

133. Специфические IgG выявляются у больных с I стадией – в 50–70% случаев, II стадией – в 65–100%, III стадией – до 100%.

134. Наличие IgМ к антигенам боррелий в сыворотке крови больных ЛБ указывает на раннюю стадию инфекции. В некоторых случаях IgM могут выявляться в течение 1–2 лет. Оба класса специфических иммуноглобулинов (G и М) могут определяться более 10 лет. Долго они сохраняются и после антибиотикотерапии.

135. Серологический анализ не всегда подходит для контроля эффективности лечения из-за отсутствия доказательств элиминации боррелий.

Иммуноглобулины класса G вырабатываются против целого ряда боррелиозных антигенов, пик синтеза данного класса антител приходится на 6–8-ю неделю после начала инфекции. Их наличие, как правило, характеризует острую диссеминированную или хроническую органную манифестацию инфекции (II и III стадии).

136. Выявление IgG при раннем боррелиозе, при отсутствии IgM и клинической симптоматики заболевания, возможно, указывает на предшествующий контакт с боррелиями, который пациент не зафиксировал вследствие бессимптомного или абортивного течения инфекции. При наличии признаков поражения центральной нервной системы необходимо проводить анализ специфических антител в спинномозговой жидкости, так как отрицательный результат анализа сыворотки крови у больного нейроборрелиозом не свидетельствует об отсутствии у него инфекции.

137. Для позднего боррелиоза характерно значительное повышение титров IgG, особенно при атрофическом акродерматите (до 100% случаев). В литературе описаны немногочисленные примеры серонегативного Лайм-боррелиоза с клинически неясными симптомами, что, в основном, обусловлено иммуносупрессией разного генеза. В таких случаях для адекватной диагностики особо значимым является обнаружение у обследуемых лиц непосредственно возбудителя инфекции.

138. Методология серодиагностических исследований.Согласно рекомендаций Второй национальной конференции по серологической диагностике болезни Лайма (1994г.), для выявления активной инфекции используют двухшаговый принцип серологической диагностики, который значительно увеличивает эффективность исследования.

139. С этой целью на первом этапе серологического обследования рекомендуют использовать чувствительный иммуноферментный или иммунофлюоресцентный тест, на втором – последующее подтверждение результатов анализа с помощью метода иммунного блоттинга, который позволяет выявить ложноположительные результаты, полученные на первом этапе исследования, и тем самым повысить специфичность анализа.

140. Однако серодиагностика болезни Лайма существенно осложняется антигенной гетерогенностью представителей B.burgdorferi sensu lato, оказывающей негативное влияние на показатели чувствительности и специфичности используемых диагностических тест-систем.

141. Реакция непрямой иммунофлюоресценции. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) является первым методом, широко примененным для серодиагностики боррелиозов. Основной компонент, используемый для постановки РНИФ, инактивированные боррелии (корпускулярный антиген), фиксированные на предметном стекле. Инкубация сыворотки больного с корпускулярным антигеном приводит к связыванию специфических антиборрелиозных антител.

142. Визуализацию комплекса антиген-антитело осуществляют с помощью иммунофлюоресцентной антисыворотки против иммуноглобулинов человека и учетом результатов анализа в люминесцентном микроскопе. Метод прост и недорог в исполнении, обладает неплохой чувствительностью, но недостаточно специфичен из-за наличия перекрестных реакций с другими микроорганизмами, в частности, с Treponema pallidum.

143. В качестве антигена обычно используют штамм Ip-21 B. afzelii. Диагностически значимым в РНИФ считают титр специфических антител 1:40 и выше.

144. Иммуноферментный метод. Иммуноферментный анализ (ИФА) антител к антигенам B. burgdorferi sensu lato в настоящее время является основным методом, применяемым в развитых странах в лабораторной диагностике клещевых боррелиозов. Особое значение в создании стандартизованных тест-систем, обладающих высокой диагностической эффективностью, имеет выбор антигенов, используемых вкачестве иммуносорбента. С этой целью применяют: грубые экстракты боррелий, нативные очищенные антигены, рекомбинантные антигены боррелий комплекса B. burgdorferi sensu lato и синтетические пептиды.

ЛЕЧЕНИЕ

145. Лечение клещевых боррелиозов должно быть комплексным, включать адекватную этиотропную, симптоматическую и патогенетическую терапию, а также проводиться с учетом стадии болезни, клинической симптоматики и наличия осложнений.

146. Выбор схемы лечения клещевого боррелиоза должен быть сделан с учетом чувствительности боррелий к тем или иным антибактериальным препаратам. Кроме этого, необходимо учитывать особенности патогенеза боррелий (длительный период генерации и возможность формирования цистных форм, внутриклеточную локализацию возбудителя, присутствие боррелий в тканях с плохим кровоснабжением).

147. Известно, что боррелии способны становиться резистентными к препарату лечения, а также то, что их разные виды имеют неодинаковую чувствительность к антибактериальным препаратам.

148. Боррелии обладают устойчивостью к аминогликозидам, триметоприму, сульфаметоксазолу, ингибиторам гиразы, рифампицину, сульфаниламидам 5-флуорацилу, фосфомицину, частично к рокситромицину. In vitro микроорганизм наиболее чувствителен к макролидам и цефалоспоринам третьего поколения (цефтриаксону и цефотаксиму).

149. По эффективности бактерицидного действия на боррелии цефалоспорины, предназначенные для перорального применения, можно расположить в следующем порядке: цефуроксим>цефиксим, цефдинир>цефподоксим>цефаклор>цефтибутен, лоракарбеф>цефетамет-бапрамицин.

150. Однако результаты исследований in vitro не всегда совпадают с эффективностью антибиотиков in vivo. Так, например, оказалась неэффективной комбинация препаратов эритромицина с пенициллином G для лечения животных с боррелиозной инфекцией.

151. Схемы лечения.Общепринятой схемы лечения клещевых боррелиозов до настоящего времени не существует. В таблице 6 приведены наиболее широко используемые схемы лечения, заимствованные из зарубежных и российских источников.

152. Нелеченая мигрирующая кольцевидная эритема может исчезнуть спонтанно, в среднем через 1 месяц. Антибактериальная терапия на I стадии инфекции значительно снижает вероятность развития неврологических, кардиальных и артралгических осложнений, может предотвратить переход во II и III стадии заболевания.

153. Длительность терапии – от 10 дней для болезни с кожными проявлениями до 20–30 дней при диссеминированной инфекции. В случае Лайм-артрита антибиотики принимают в течение 30 и более дней (таблица приложения).

154. Благоприятный исход болезни и выздоровление во многом зависит от своевременности и адекватности этиотропной терапии, проводимой в острый период болезни. В случае неврологических и суставных поражений прогноз в отношении полного выздоровления неблагоприятен.

ПРОФИЛАКТИКА

155. Мероприятия по предупреждению заражений ЛБ в настоящее время сводятся только к неспецифической профилактике, поскольку вакцина не разработана и препараты для специфической серопрофилактики отсутствуют.

156. Меры неспецифической профилактики БЛ включают организацию и проведение борьбы с клещами-переносчиками в природных очагах, индивидуальную защиту от клещей с помощью специальных костюмов и репеллентов, проведение само- и взаимоосмотров, а также санитарно-просветительную работу. Обнаруженный клещ должен быть немедленно удален, а место присасывания смазано йодом. Использование акарицидов (препаратов, убивающих клещей) ограничено.

157. Поскольку основные переносчики ЛБ те же, что и при клещевом энцефалите, главные черты эпидемиологии этих инфекций чрезвычайно близки, а их природные очаги приурочены к одним и тем же территориям, мероприятия по неспецифической профилактике ЛБ следует организовывать и проводить совместно с таковыми по клещевому энцефалиту.

158. В санитарно-просветительной работе необходимо дополнительно обращать особое внимание на важность незамедлительного обращения к врачу при появлении мигрирующей эритемы (увеличивающегося от места укуса клеща покраснения) независимо от самочувствия пациента, причем даже в тех случаях, когда прикрепившийся клещ был быстро удален с поверхности тела.

159. Своевременная антибиотикотерапия по назначению врача в подобной ситуации может предотвратить развитие заболевания. Как показали исследования, применение однократной дозы доксициклина (200 мг) дает 87%-й эффект защиты от развития клещевого боррелиоза при использовании данного антибиотика в течение трех суток после присасывания клеща.

Заключение

160. Таким образом, патогенные для человека виды боррелий комплекса B. burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii) являются причиной развития разнообразных патологических состояний у человека. Представленные в настоящих методических рекомендациях сведения могут быть полезными для широкого круга специалистов, занимающихся диагностикой, лечением и профилактикой клещевых боррелиозов.

Приложение к методическим

рекомендациям «Эпидемиология, клиника,

лечение, диагностика и профилактика

клещевых боррелиозов»

Таблица - Схемы лечения клещевых боррелиозов

Стадии инфекции	Этиотропная терапия
Ранний локализо- ванный Лайм-боррелиоз, I стадия	Доксициклин 100 мг дважды в день, per os в течение 14–21 дня (взрослым) (широко). Амоксициклин 250 мг три раза в день или 50 мг на кг веса тела в течение 14–21 дня (обычно детям менее 8 лет) или 500 мг 4 раза в сутки внутрь или 3х1000 мг (детям 3х10 мг/кг) (широко). Цефуроксим 500 мг перорально дважды в день в течение 14–21 дня (обычно при аддергии к доксициклину или амоксициклину) (мало). Тетрациклин в дозе 1,0–1,5 г/сутки в течение 10–14 дней (нет данных). Ампициллин в суточной дозе 1,5–2,0 г в течение 10–30 дней (нет данных). Эритромицин, который назначают больным при непереносимости других антибиотиков в дозе 250 мг 4 раза или 30 мг/кг в сутки в течение 10–30 дней (нет данных). Рокситромицин 3х500 мг, per os (мало). Азитромицин (сумамед) 2х500 мг, per os в течение 5–10 дней (очень редко).
Ранний диссеминированный Лайм-боррелиоз, II стадия	Цефтриаксон в дозе 1х2 г (детям 60 мг/мл) в сутки внутривенно 14–28 дней (широко). Рекомендуется назначать при ранних и поздних неврологических расстройствах, высокой степени атриовентрикулярной блокады, артритах (в том числе хронических). Цефотаксим 3х2 г (детям 3х30 мг/кг) в сутки внутривенно 14 дней (широко). Доксициклин 2х100 мг, per os 14 дней (редко). Бензилпенициллин в дозе 20 млн. Ед/cутки (введение доз через 4–6 ч) также эффективен. Длительность терапии не менее 10 дней (нет данных).
Поздний Лайм-боррелиоз, III стадия	Цефтриаксон в дозе 1х2 г (детям 60 мг/мл) в сутки внутривенно 21 день (широко). Рекомендуется назначать при ранних и поздних неврологических расстройствах, высокой степени атриовентрикулярной блокады, артритах (в том числе хронических). Цефотаксим 3х2 г (детям 3х30 мг/кг) в сутки, внутривенно 21 дней (широко) или 2–3х4 г: пульс-терапия) 6–8 циклов (редко). Доксициклин 2х100 мг, per os 21 день (редко), до 30–60 дней при Лайм-артрите.