Тема 8: Экспериментальный мутагенез

План

1. Понятие о мутациях и мутационной изменчивости.

2.Получение мутантов с помощью излучения

3.Получение мутантов с помощью химических веществ

4.Селекционная работа с мутантами Достижения мутационной селекции

1.Генетические структуры клетки способны изменяться под влиянием различных физических и химических факторов. Генетически стойкие изменения в генах и хромосомах называются мутациями. Новый организм с изменённым признаком вследствие мутирования гена или перестройки хромосомы называют мутантом. Мутации могут быть полезными, вредными или нейтральными для организма. Большинство из них вредные или даже летальные, например хлоро-фильные мутации.

Мутагенами называют различные физические и химические факторы, с помощью которых получают индуцированные мутации. Из них используют главным образом различного типа излучения и химические вещества.

Основы теории мутаций были заложены в трудах Х. Де Фриза (1901-1903), вскоре после переоткрытия законов Г. Менделя. Представления о скачкообразном изменении наследственных свойств были впервые сформулированы русским ботаником С.И. Коржинским, который обосновал мутационную теорию эволюции в своём труде «Гетерогенезис и эволюция» (1899).

Основные положения мутационной теории С.И. Коржинского -Х. де Фриза сводятся к следующему:

1. Мутации возникают внезапно как дискретные изменения признака.

2. Новые формы стабильны.

3. В отличие от ненаследственных изменений мутации не образуют непрерывных рядов, не группируются вокруг какого-либо среднего типа. Они являются качественными изменениями.

4. Мутации проявляются по-разному и могут быть как полезными, так и вредными.

5. Вероятность обнаружения мутаций зависит от размера выборки исследованных особей.

6. Сходные мутации могут возникать неоднократно.

Строгие доказательства возникновения мутаций впервые были представлены В. Иоганнсеном (1908-1913), изучавшим наследование количественного признака - массы семян в чистых линиях фасоли и ячменя.

Мутационный процесс подчинён определённым законам. Так Н.И. Вавилов в 1920 г. установил, что мутации у генетически близких видов имеют большое сходство (закон гомологических рядов). Мутации, возникающие случайно в разных направлениях, при объединении их в системе вида обнаруживают общую закономерность.

Первая удачная попытка индуцирования мутаций была осуществлена академиком Г.А. Надсоном и его учеником Г.С. Филипповым в Ленинграде на микроорганизмах (грибах). В 1925 г. они показали, что с помощью рентгеновского излучения можно во много раз увеличить мутационную изменчивость. Однако первенство в этом открытии перешло к американскому учёному Г.Д. Мёллеру, который в 1927 г. на V Международном генетическом конгрессе в Берлине показал на примере дрозофилы высокую мутагенную активность рентгеновского излучения.

В 1928-1930 гг. А. А. Сапегин и Л.Н. Делоне использовали излучения для получения исходного материала в селекции зерновых культур. А.А. Сапегин получил рентгеномутанты у мягкой и твёрдой пшеницы, отличающиеся от исходных форм по разным признакам, в том числе мутантную форму с повышенной морозостойкостью от сорта Кооператорка. В 1928 г. американский генетик Л. Стадлер успешно индуцировал с помощью рентгеновского излучения мутации у кукурузы и ячменя.

Широкие исследования по мутагенезу проводились в нашей стране с начала 50-х гг. под руководством Н.П. Дубинина, И.А. Рапопорта, В.В. Хвостовой и П.К. Шкварникова после открытия высокоэффективных мутагенов.

В условиях Западной Сибири исследования по искусственному получению мутаций у яровой пшеницы были начаты в 30-е гг. в ОмСХИ М.С. Бодровым и в 1958 г. - в ИЦиГе СО РАН П.К. Шквар-никовым и И.В. Чёрным.

5 февраля 1979 г. в СибНИИСХе Р.И. Рутцем была создана лаборатория экспериментального мутагенеза, где с использованием метода мутагенеза созданы многие сорта пшеницы (Омская озимая, Сибирская Нива, Омская 4, Жатва Алтая, Росинка, Росинка 2, Славянка Сибири, Росинка 3 и др.).

В селекции с помощью индуцированного мутагенеза можно решать следующие задачи:

1) обеспечение изменчивости с широким спектром мутаций и высокой частотой их проявления в целях получения исходного материала для отбора;

2) получение мутантов со специфическими изменениями отдельных признаков в целях исправления отдельных дефектов сортов. При этом другие хозяйственно важные признаки должны остаться без изменений;

3) увеличение рекомбинации генов и разрыв нежелательного сцепления генов;

4) осуществление переноса фрагментов хромосом одного вида в хромосомы других видов при отдалённой гибридизации;

5) получение гомозиготных мутантов путём воздействия на гаплоиды излучениями и последующего удвоения у них числа хромосом и т. д.

2.Излучения, вызывающие мутации, бывают двух видов: ионизирующие и неионизирующие.

Среди ионизирующих излучений в селекционной работе наиболее широко применяют: 1) рентгеновское излучение; 2) гамма-излучение; 3) нейтронное излучение.

Ионизирующими они называются потому, что способны превращать атомы и молекулы в электрически заряженные частицы - ионы.

Рентгеновское излучение стали использовать в селекции для получения мутаций раньше всех других источников. Рентгеновские аппараты имеются во многих учреждениях, легко

управляются, на них удобно работать с любыми органами растения, несложно изменять дозы излучения.

Источником гамма-излучений обычно служит радиоактивные кобальт (60Со) или цезий (137Сб). Для кратковременного облучения служат специальные мощные облучающие установки. Длительное воздействие на растения малыми дозами (хроническое облучение веге-тирующих растений) проводят на гамма-поле. Нейтроны возникают в результате ядерных реакций, в частности при делении ядер урана и плутония. Различают быстрые нейтроны (энергия ионообразования 0,2-26 МэВ) и медленные, или тепловые (энергия - 0,025 эВ). Быстрые нейтроны оказывают мутагенное действие преимущественно в момент облучения, а тепловые вызывают наведённую радиоактивность в самой клетке. Относительная биологическая эффективность нейтронов в 10-40 раз выше, чем гамма- и рентгеновского излучения.

Частота появления мутаций зависит от дозы излучения. Существует положительная линейная зависимость между дозой излучения и частотой мутаций. Однако эта зависимость наблюдается в основном в интервале 100%-ной выживаемости. С переходом в интервал ЛД0 - ЛД100 (ЛД0 - порог выживаемости, ЛД100 - гибель всех растений) выход мутаций уже не может увеличиваться пропорционально дозе, поскольку будет гибнуть больше растений.

Дозы мутагенов следует подбирать с учётом видовой принадлежности растений, физиологического состояния органов растения и других факторов.

Например, у риса удаление чешуй с семян повышает их радиочувствительность. На покоящиеся семена нужно воздействовать большей дозой, чем на прорастающие. Вегетативные органы более чувствительны к излучению, чем покоящиеся семена.

Для получения мутаций следует воздействовать достаточно высокой дозой, чтобы обеспечить большее число полезных наследственных изменений. Необходимо установить для каждого вида сельскохозяйственных культур критическую дозу радиации, выше которой уже наблюдается значительное снижение жизнеспособности и плодовитости растений. За критическую дозу принимают такую дозу, при воздействии которой выживают 30-40% растений (ЛД30-40). Критическая доза у различных сельскохозяйственных культур при обработке сухих семян варьирует от 50 до 2000 Гр.

Установлено, что сорта разной плоидности обладают неодинаковой радиочувствительностью и разным спектром мутаций. Например, у гречихи тетраплоиды значительно более устойчивы к гамма-излучению, чем диплоиды. Было показано, что с увеличением уровня плоидности у пшеницы частота хлорофильных мутантов уменьшается, а морфологических и других видимых мутантов возрастает.

Кроме этого, различные сорта одного вида с одинаковым набором хромосом могут иметь разную радиочувствительность. Например, у сортов гороха Торсдаг, Рамонский 77, сои Кубанской 276, яровой пшеницы Теремок воздействие гамма-лучей на семена обусловило появление значительного количества мутаций с широким спектром, в том числе по скороспелости, продуктивности, склонности к полеганию. В тех же опытах абиссинская форма гороха, карликовый сорт сои, сорт ярового ячменя Винер оказались маломутабильными. Поскольку разные сорта часто отличаются по чувствительности к мутагенам и имеют неодинаковый спектр мутаций, для получения желаемых результатов нужно вовлекать в работу больше сортов.

При высоких дозах излучения, дающих сильный повреждающий эффект, доля хозяйственно-ценных мутаций меньше, чем при средних дозах. Поэтому в селекционных целях рекомендуется использовать дозы излучения в 1,5-2 раза ниже критических.

При облучении семян нейтронами оптимальная доза для пшеницы и ячменя составляет 2,5-7,5 Гр (250-750 рад), гороха и других зернобобовых - 3-5 Гр (300-500 рад), для ростков и клубней картофеля - 7,5 Гр (750 рад).

Генетически эффективным неионизирующим излучением считают ультрафиолетовое (УФ) излучение. Оно имеет значительно большую длину волны (200-400 нм), чем ионизирующие излучение, и меньшую энергию. При его использовании происходит только возбуждение молекул.

Проникающая способность УФ-излучения очень мала. Поэтому его можно использовать только для обработки пыльцевых зёрен. УФ-излучение вызывает высокую частоту мутаций, особенно в пределах длины волны, которая поглощается ДНК (260-265 нм). Например, при обработке пыльцы кукурузы УФ-лучами с длиной волны 253 нм

в дозе 10 Дж/м наблюдается угнетение оплодотворения, а при увеличении дозы до 10-10 Дж/м пыльца становится полностью стерильной.

При воздействии на семена и вегетирующие растения импульсным и непрерывным лазерным излучением видимой области спектра также можно получать высокий выход мутантных форм.

На эффект излучений с низкой ЛПЭ (гамма- и рентгеновские лучи) сильно влияют факторы среды. Повреждающее действие этих излучений усиливается при наличии кислорода во время облучения и облучении набухших семян; кроме того, на степень их повреждения оказывают влияние влажность семян, температура, длительность хранения и ряд других факторов. Длительное хранение семян в течение нескольких месяцев или даже недель усиливает повреждение хромосом, клеток и организма в целом.

Для повышения частоты мутаций, а также для последовательного индуцирования мутаций ряда генов, действующих на развитие одного признака для усиления степени его выраженности, применяют многократное облучение. По данным В.Г. Володина, частота мутаций после однократного облучения составляет 1%, а после пятикратного - 12%. При пятикратном последовательном облучении ряда поколений дикого мелкоплодного томата (плоды размером с крупную клюкву) Г. Штуббе удалось отобрать формы с плодами такой же величины, как у культурных мелкоплодных сортов. Повторное облучение в те-

чение нескольких лет семян ячменя применяли также на Свалёфской селекционной станции.

Снятие повреждающего эффекта излучений. Метод снятия повреждающего эффекта применяется для излучений с малой ЛПЭ. При облучении нейтронами этот метод не применим. Суть метода в том, что семена облучают на сухом льду, затем сразу после облучения в течение 1 мин замачивают в горячей (60°С) дистиллированной воде и на 1 ч 30 мин помещают в кипячёную воду (бескислородную, дистиллированную) температурой 32-35°С. После этого семена подсушивают и высевают. Такая процедура резко снижает количество перестроек хромосом и значительно (на 50%) повышает частоту генных мутаций.

3. Возможность получения мутаций под влиянием химических веществ была установлена в начале 30-х гг. ХХ в. Многие высокоактивные мутагены, в том числе этиленимин, впервые были открыты И.А. Рапопортом (1943) и Ш. Ауэрбах (1944). Мутагенные вещества относятся к различным классам химических соединений. Наиболее важные мутагены: этилметансульфонат, диэтилсульфонат, 1,4-бисдиазоацетил-бутан, нитрозоалкилмочевина и др.

Химическими мутагенами можно обрабатывать сухие и проросшие семена, черенки, клубни, луковицы, инъекцировать эти вещества в стебель растений перед вступлением их в генеративную фазу и т. д. Продолжительность обработки семян варьирует от 3 до 18 ч. Концентрация мутагенов для каждой культуры и сорта устанавливается в специальных предварительных опытах. Ориентировочно рекомендуют следующие концентрации мутагенов для обработки сухих семян: этиленимин - 0,01-0,06 (% по объёму); ЭМС - 0,1-0,5; гидроксила-мин - 1,5-3,0 и т. д. Установлено, что с увеличением концентрации мутагена до определённого уровня частота жизнеспособных мутаций возрастает, затем происходит её снижение в результате гибели клеток, в которых возникли изменения при повышении концентрации мутагена сверх оптимальной величины. Следовательно, в селекционной работе использование высоких концентраций мутагенов нецелесообразно. Они не должны быть и слишком низкими. Во многих случаях химические мутагены оказываются эффективнее физиче-

ских. Если под влиянием излучений возникает 10-15% жизнеспособных мутантов, то химические мутагены позволяют получить 30-60%.

Разработаны следующие методы обработки химическими мутагенами:

1. Обработка семян парами химических мутагенов («обработка в газовой фазе»). Метод разработан в отделе химического мутагенеза под руководством И.А. Рапопорта. Он заключается в том, что сухие или проросшие семена помещают в эксикатор, куда добавляют несколько капель хорошо испаряющегося химического мутагена. Семена поглощают пары мутагена и подвергаются воздействию. Метод оказался эффективным для 1,4-бисдиазоацетилбутана, этиленимина и других быстро испаряющихся мутагенов.

2. Обработка клеток стеблевой меристемы у проростков. По наблюдениям многих авторов, митозы при прорастании семян в клетках корневой меристемы начинаются несколько раньше, чем в клетках стеблевой меристемы. Повреждение корешков при обработке семян химическими мутагенами может быть барьером, ограничивающим частоту мутаций. Н.Д. Тарасенко (1968) предложил метод обработки, при котором воздействию подвергаются клетки только стеблевой меристемы. Семена проращивают и обрабатывают мутагеном. После обработки проростки промывают водой и высаживают. Обработка раствором ЭМС и гидроксиламином у проростков только клеток стеблевой меристемы увеличивает частоту семей с мутациями в 2-2,5 раза при более высокой выживаемости растений М1 по сравнению с обработкой сухих семян или обработкой проростков целиком.

3. Применение химических мутагенов вместе со стимуляторами роста. Предварительно готовят раствор стимулятора роста, а перед обработкой семян или проростков растворяют в нём химический мутаген. По данным, полученным на ячмене, частота семей с мутациями значительно возрастает при использовании таких стимуляторов роста, как натриевая соль нафтеновых кислот, ^-индолилуксусная кислота (гетеро-ауксин) и «-нафтилуксусная кислота совместно с этилметансульфона-том (ЭМС), N-N-нитрозогуанидином и нитрозометилуретаном.

4. Обработка завязей ячменя через 48-72 ч после оплодотворения. При этом завязь имеет очень малый размер, зародыш состоит из нескольких десятков клеток. Обработка проводится путём замачивания колосьев в пробирке с мутагеном. Для лучшего проникновения мутагена к завязи цветочные чешуйки обрезаются на ½-2/3. После замачивания на колосья надеваются целлофановые изоляторы, для задержки высыхания мутагена (Н.Д. Тарасенко, 1972). Частота семей с мутациями достигает 92 и 87% при использовании ЭМС и НММ (0,05%-ные водные растворы) соответственно.

5. Совместное использование специфических ферментов и химических мутагенов. Метод основан на совместном использовании специфических ферментов (на семенную и клеточную оболочки) и химических мутагенов. Это позволило быстро вводить химические мутагены в клетку. Например, при замачивании семян ячменя в растворе пектиназы, лизоцима и других ферментов совместно с этилме-тансульфонатом, чувствительность семян увеличивается в 2 раза, а частота мутаций в М2 - в 2-3 раза по сравнению с контрольным вариантом. Частота семей с хлорофилльными мутациями достигает при этом 100% семей М2. Если учесть, что на каждую хлорофилльную мутацию приходится 5-10 мутаций по количественным признакам, то этот метод позволяет значительно сократить объём работы и ускорить получение ценных форм.

6. Обработка методом вакуум-инфильтрации. Метод заключается в том, что проростки вместе с раствором физиологически активных веществ помещают в эксикатор. Затем через шланг выкачивают воздух и доводят давление в нем до 50-100 мм ртутного столба. Имеющиеся в растворе и тканях газы быстро удаляются. После этого давление в эксикаторе доводят до нормального и раствор быстро проникает в ткани.

Снижение повреждающего эффекта при обработке химическими мутагенами. Удалось разделить повреждающий и мутагенный эффект химических факторов. Бендер и Гауль рекомендуют промывать семена в проточной воде после обработки химическими мутагенами не менее 24 ч; по-видимому, при этом из семян удаляется большая часть вредных продуктов гидролиза ЭМС (метасульфоновая кислота и этиловый спирт). Этот приём снижает повреждение хромосом и увеличивает выживаемость растений М1.

4. В селекционной работе с мутантами применяют два метода.

1. Прямой отбор индуцированных мутаций для непосредственного использования их в качестве улучшенных сортов. В ряде случаев отбор лучших растений в мутантных семьях даёт положительные результаты. Например, в опытах В.С. Можаевой, проведённых на озимой пшенице, внутри мутантных линий эректоида 72 удалось выделить наиболее продуктивные и зимостойкие формы с зерном повышенного качества. Эффективность отбора объясняется в данном случае возникновением малых мутаций, влияющих на количественные признаки.

2. Использование мутаций в сочетании с гибридизацией. Возможны такие комбинации скрещиваний: мутант с исходным сортом; разные мутанты между собой в пределах одного и того же сорта; мутанты, выделенные у разных сортов, при воздействии разными мутагенами.

Ценный материал для гибридизации представляют мутанты, у которых один-два важных признака изменены в положительную сторону, хотя по общей продуктивности они не превосходят исходный сорт. Например, у гороха часто встречаются низкорослые сильно ветвящиеся мутанты. При скрещивании их с исходным сортом, как показали опыты К. К. Сидоровой, удаётся получать высокорослые ветвящиеся растения, отличающиеся высокой продуктивностью.

У пшеницы встречаются мутанты, устойчивые к полеганию, но с низкими хлебопекарными качествами или мутанты с очень упругой клейковиной, но сильно полегающие. В опытах И.В. Чёрного скрещивание таких мутантов между собой позволило получить формы, устойчивые к полеганию, с высокими хлебопекарными качествами.

При использовании мутагенеза проводят «накопительные» скрещивания. Если в результате воздействия мутагенами появились аддитивно ценные мутации, то они наверняка возникли в разных растениях и максимальный эффект могут дать в том случае, когда окажутся в одной линии. Для объединения аддитивно ценных мутаций проводят накопительные скрещивания полученных после воздействия мутагенами линий по схеме: [(А х В) х (С х Д) х (Е х Ж) и т. д.].

Мутанты, выделенные в одних почвенно-метеорологических условиях, могут оказаться более продуктивными в других условиях. Например, в опытах К.К. Сидоровой и Г.А. Дебелого компактный, более устойчивый к полеганию мутант гороха, выделенный из сорта Торсдаг, при испытании в Новосибирской области уступал по урожайности исходному сорту, а в условиях Подмосковья дал значительную прибавку урожая.

Литература:

1. Сагалбеков Е.У., Зотова Л.П. Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур, Астана: Издательство Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина, 2015.-258с.

2. Таранухо Г.И. Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур: Учебник. – Минск: ИВЦ Минфина, 2009. – 420 с.

3. Ведров Н.Г. Селекция и семеноводство полевых культур: учеб. пособие. - Красноярск, 2008.-300 с.

4. Пыльнев В.В., Коновалов Ю.Б., Березкин А.Н. Практикум по селекции и семеноводству полевых культур: Учебное пособие (практикум). – М.: «КолоС», 2008. – 404 с.

5. Малицкая Н.В., Сыздыкова Г.Т., Аужанова М.А. Семеноводство зерновых культур в Северном Казахстане: курс лекций. - Петропавловск: СКГУ им. М. Козыбаева, 2016.-90с.

Тема 9:Использование полиплоидии, гаплоидии и анеуплоидии в селекции..

План

1.Понятие о полиплоидии. Естественные и искусственные полип­лоиды

2.Типы полиплоидов и их различия. Требования к объектам полиплоидии

3.Техника получения полиплоидов

4.Использование анеуплоидов в селекции

5.Получение и использование гаплоидов

1.Полиплоидией называют изменчивость, связанную с кратным увеличением основного числа хромосом в клетках организма. Для полиплоидов характерно более мощное развитие вегетативных и ре­продуктивных органов, что вызвано увеличением у них размеров кле­ток. Полиплоидия играет большую роль в эволюции культурных рас­тений. Большинство родов покрытосеменных растений включают по­липлоидные виды (1/3 от всех изученных видов). Ряд важнейших сельскохозяйственных культур представляют собой полиплоидные формы. Обычно более ценными оказываются формы с большим чис­лом хромосом. Например, гексаплоидная мягкая пшеница, твёрдая пшеница (10-11% мировых посевов данной культуры). Диплоидная культурная однозернянка возделывается на незначительной площади. Полиплоидия в природе обнаружена у таких культур, как картофель (2n = 48), хлопчатник (2n = 26; 52), табак (2n = 48), арахис (2n = 20; 40), люцерна (2n = 16; 32; 48) и др. Однако у таких культур, как рожь (2n = 14), ячмень (2n = 14) и свёкла (2n = 18), в природе обнаружены только диплоидные виды.

В селекции растений полиплоидию как практический приём ста­ли применять после открытия А. Блексли в 1937 г. направленного по- липлоидизирующего действия колхицина на делящиеся клетки расте­ний. Колхицин - это алкалоид, выделенный из семян и клубнелуковиц безвременника осеннего.

Экспериментальная полиплоидия позволяет решать следующие проблемы селекции и генетики растений:

1) Повышение продуктивности.

2) Преодоление самонесовместимости.

3) Преодоление межродовой и межвидовой нескрещиваемости.

4) Восстановление плодовитости у отдалённых гибридов.

5) Закрепление гетерозиса.

6) Проведение синтеза и ресинтеза видов.

Установление групп сцепления при генетическом анализе.

2.В селекции используют два типа полиплоидов: аутополиплоиды и аллополиплоиды. Аутополиплоиды получают путём кратного увели­чения в клетках наборов хромосом одного и того же вида (АА - АААА). Аллополиплоиды - соединением в одном геноме хромосомных наборов разных видов с последующим удвоением числа хромосом у гибридов F1 (АА х ВВ = F1АB - AABB). Аллополиплоиды получают также пу­тём скрещивания разных аутополиплоидов (АААА х ВВВВ = F1ААВВ). Сегментные аллополиплоиды - это промежуточные между аутополи- плоидами и аллополиплоидами формы, у которых хромосомы разных геномов различаются не по всей длине, а частично.

Основные различия между аутополиплоидами и аллополиплоидами:

1Фертильность наиболее сильно снижается у аутополиплоидов, что связано с нарушениями процесса мейоза, особенно у культур, возделываемых на семена. У аллополиплоидов хромосомы каждого типа представлены парами, поэтому мейоз протекает нормально и плодовитость снижается меньше, чем у аутополиплоидов.

2Морфологически аутополиплоид сходен с родительской фор­мой, а аллополиплоид занимает промежуточное положение между родительскими видами и похож на гибрид между ними.

Известный шведский селекционер А. Леван (A. Levan, 1942) сформулировал основные положения, указывающие, какие растения наиболее перспективны для полиплоидизации.

3Растения с небольшим числом хромосом лучше реагируют на их удвоение, чем растения с высоким числом хромосом.

4Перекрёстноопыляющиеся культуры более подходят для се­лекции на основе полиплоидии, чем самоопылители. У них скорее восстанавливается фертильность.

5Чем более гетерозиготен материал, тем больше шансов полу­чить выгодную новую комбинацию. Поэтому в качестве исходного материала для полиплоидизации целесообразно брать гибридный ма­териал.

Растения, у которых используются вегетативные части, пред­ставляют более перспективный материал для полиплоидии, чем вы­ращиваемые на семена (Е.П. Раджабли, В.Д. Рудь, 1972).

Кроме того, при использовании в селекции метода эксперимен­тальной полиплоидии следует учитывать, что для разных видов рас­тений характерен определённый оптимальный уровень плоидности (геномный оптимум), после достижения которого при дальнейшем увеличении числа хромосом интенсивность роста растений снижает­ся. Например, удвоение числа хромосом у мягкой пшеницы приводит к слабому развитию растений. Наоборот, у ржи удвоение хромосом увеличивает мощность и продуктивность растений. Кроме того, при использовании в селекции метода эксперимен­тальной полиплоидии следует учитывать, что для разных видов рас­тений характерен определённый оптимальный уровень плоидности (геномный оптимум), после достижения которого при дальнейшем увеличении числа хромосом интенсивность роста растений снижает­ся. Например, удвоение числа хромосом у мягкой пшеницы приводит к слабому развитию растений. Наоборот, у ржи удвоение хромосом увеличивает мощность и продуктивность растений.

3Для искусственного индуцирования полиплоидии используются различные факторы, которые в основном вызывают полиплоидиза- цию и в природе. Физические - температурные воздействия, ионизи­рующие излучения. Механические - повреждение тканей, центрифу­гирование. Из химических веществ применяют колхицин, аппиоль (экстракт из семян петрушки), ауранцию (в 100 раз эффективнее кол­хицина), закись азота (этот газ применяют под давлением в несколько атмосфер, воздействуя на цветки после оплодотворения). Для полу­

чения полиплоидов используют также аценафтен, хлористый сангуи- нарин, гаммексан, линдан и другие вещества.

Из ранних приёмов экспериментального получения полиплоидов наиболее эффективными были методы декапитации и воздействия высокими температурами. Сущность метода декапитации сводится к возможности получения тетраплоидных побегов из регенерирующей ткани каллюса после удаления верхушки растения. Этим методом по­лучены тетраплоиды томатов, капусты и других культур. Под воздей­ствием высокой температуры на зиготу в стадии первого деления бы­ли получены тетраплоидные формы у кукурузы, ржи, пшеницы, яч­меня, донника белого, люцерны и льна. Полиплоиды можно выделить из близнецовых зародышей, возникающих в результате естественной полиэмбрионии.

Новые методы получения полиплоидов основаны на использова­нии генетического контроля над процессами полиплоидизации. Например, у кукурузы известен рецессивный ген elongate, который в гомозиготном состоянии вызывает образование диплоидных яйцекле­ток. Этот ген можно ввести в любую инцухт-линию. Для индуциро­вания полиплоидии в процессе оплодотворения используют также ге­ны асинапсиса. Действие этих генов приводит к образованию нереду­цированных гамет и как следствие - к возникновению полиплоидов.

К генетическим методам относится получение полиплоидов в результате межвидовых и межродовых скрещиваний, которые приво­дят к аномальному прохождению мейоза у гибридов.

В настоящее время в селекции для получения полиплоидов чаще используют колхицин в виде водных растворов, ланолиновой пасты и в виде раствора в агаре или глицерине. В чистом виде колхицин представляет собой желтовато-белый порошок, растворимый в воде, спирте и хлороформе. Химическая формула колхицина - С₂2Н₂₅О₆К.

Получение полиплоидов с помощью алкалоида колхицина осно­вано на том, что это соединение оказывает наркотическое действие на делящиеся клетки, препятствуя расхождению в митозе сестринских хромосом к противоположным полюсам и образованию дочерних клеток. В результате клеточная перегородка не образуется и сама клетка не делится. Удвоенные хромосомы остаются в одной исходной клетке. Когда наркотическое действие проходит, клетка делится и да­ёт начало двум тетраплоидным клеткам. Таким образом, действие колхицина заключается в подавлении функции веретена деления, в результате чего парализуется расхождение дочерних хромосом к по­люсам и они остаются в одной клетке.

Обычно готовят 1-2%-ный раствор, а затем его разбавляют до нужной концентрации. Колхицин характеризуется большой стойко­стью, поэтому его растворы можно стерилизовать в автоклаве. Ма­точный раствор хранят в темноте, т. к. на свету колхицин разлагается. При работе соблюдают осторожность, т. к. колхицин - сильный яд.

Разработаны условия, повышающие эффективность действия колхицина:

1Использование меристематических тканей с максимальным количеством делящихся клеток (т. е. обрабатывают проросшие семе­на, молодые проростки, точки роста, пробуждающиеся почки, буто­ны, клубни и т. д.). Действие колхицина приводит к инактивации ве­ретена делящихся клеток. Это связано с тем, что колхицин влияет только на клетки, находящиеся в процессе деления. Вследствие этого эффективность обработки зависит от количества митозов в момент воздействия.

2Определение оптимизационных доз и экспозиций для обработки различных органов растений. Следует учитывать, что чувствитель­ность разных растений к колхицину неодинакова. Различна она и по зонам меристемы и периодам развития одной и той же культуры. Кор­невая система более чувствительна к колхицину, чем стеблевые точки роста. Поэтому корешки защищают от воздействия колхицина. Моло­дые проростки более чувствительны к колхицину, чем взрослые рас­тения. При обработке семян, проростков и корневой системы чаще ис­пользуют 0,01-0,2%-ные растворы колхицина, а при воздействии на стеблевые точки роста - 0,5-2%-ные растворы. Продолжительность экспозиции варьирует от нескольких часов до нескольких суток. Она зависит от концентрации раствора, метода обработки и чувствитель­ности объекта. Лучшие результаты даёт использование относительно высоких концентраций при непродолжительных экспозициях.

3Создание оптимальных условий для роста опытных образцов растений, во время и после обработки. При обработке семян многих культур положительные результаты даёт повышение температуры до 27-30°С (Е.П. Раджабли, 1966). Это подтвердилось в опытах по по- липлоидизации растений из семейства капустных (кормовая капуста, турнепс, кольраби и редька масличная). Для ячменя наилучшей тем­пературой является 19-21°С.

Обработка прорастающих семян и молодых ростков в услови­ях вакуума проходит более успешно и требует меньше времени. Например, тетраплоидные формы спаржи были получены путём об­работки пятидневных проростков в условиях вакуума всего в течение 10 мин.

1. Использование диметилсульфооксида - вещества, способству­ющего переносу колхицина.

2. Применение клейких веществ (агар-агар, глицерин, трагакант, ланолин).

3. Комбинирование колхицина со стимуляторами роста, которые снижают его угнетающее действие. Например, когда после обработки колхицином семена базилика высевали в песок, смоченный раство­ром гетероауксина, то 85,6% растений выживали - без стимулятора роста все проростки гибли. Положительные результаты использова­ния гетероауксина получены также с кресс-салатом, выход тетра- плоидов при этом повышался более чем в 10 раз. Полиплоидные формы винограда и чёрной смородины были получены путём обра­ботки семян колхицином с добавлением гибберелловой кислоты.

С учётом этих условий разработанряд методов получения по­липлоидов для разных культур.

1) Колхицинирование семян. Этот способ пригоден для культур с быстропрорастающими семенами. Семена подвергают обработке либо в сухом виде, либо предварительно замачивают в воде. Перед посевом семена промывают в проточной воде. Концентрация раство­ра 0,1-0,2%, экспозиция - 3-6 дней. Если предварительно замачивают в воде, то набухшие семена проращивают в чашках Петри в течение 0,5-48 ч на фильтровальной бумаге, смоченной колхицином.

Например, таким путём получают тетраплоиды картофеля, таба­ка, райграса, клевера, шелковицы и других культур. Положительная сторона метода колхицинирования семян - почти полное отсутствие химерных тканей у выросших растений. Недостаток - резко снижа­ется выживаемость проростков вследствие задержки развития корне­вой системы. Это не желательно при ограниченном количестве семян (при отдалённой гибридизации).

2) Погружение проростков в водный раствор колхицина или помещение их на фильтровальную бумагу, смоченную колхицином. Концентрация раствора 0,01-0,2%, продолжительность обработки 3­12 ч и более. Недостаток - сильная задержка в развитии и гибель проростков (семян). Для устранения этого недостатка корешки изо­лируют от действия раствора колхицина. Для этого проросшие семе­на укрепляют на специальной сетке корешками вверх. Например, у зерновых злаков проростки с колеоптилем длиной 2-4 мм опускают на 30 мин в чашку Петри корешками вверх. После этого их высажи­вают в ящики в теплице.

3) Обработка мелкосемянных культур. Семена проращивают в чашках Петри на фильтровальной бумаге. В момент наклёвывания

семян чашки переворачивают вверх дном и отрастающие корешки в результате геотропизма растут вниз. Когда они достигнут 0,5-0,8 см длины, чашки возвращают в исходное положение, семена заливают раствором колхицина, а корешки накрывают влажной фильтроваль­ной бумагой. Концентрация раствора 0,05-0,1%, экспозиция - 2 ч. Этим методом получают тетраплоиды моркови, салата, петрушки и других культур.

4)Капельный метод является одним из самых надёжных для двудольных растений. Суть его в том, что капли раствора колхицина наносят пипеткой на точку роста молодых сеянцев утром и вечером или через каждые 3-4 ч в течение 3-4 сут, иногда с перерывом на не­сколько суток. При этом используют водные растворы колхицина, водно-глицериновые и водно-агаровые (0,4% агара). Концентрация раствора 0,1-0,4%. Растения при обработке содержат на рассеянном свету, относительная влажность воздуха 70-80%. Лучше вместо вод­ных растворов использовать колхицин-трагакантовую смесь, т. к. во­да быстро испаряется. Эта смесь хорошо прилипает, не смывается при поливе.

5)Метод инъекций. При работе со злаковыми культурами рас­твор колхицина концентрацией 0,1-0,2% вводят шприцем в цен­тральную часть стебелька на уровне корневой шейки. У кукурузы об­работку этим способом проводят в фазе 1-2 листа в утренние часы. Впрыскивание заканчивают, когда вверху, в раструбе развивающего­ся листа, появляется капля раствора. Обработку повторяют в течение нескольких дней. Для пшеницы разработан метод полиплоидизации путём инъекции 0,1-1,0%-ного раствора колхицина в цветки на трёх стадиях развития: до опыления, во время опыления и после опыле­ния. У винограда инъекции проводят в молодые побеги, у капусты - в почки маточных растений на ранних стадиях их развития.

6)Метод CIMMYT. В CIMMYT при получении тритикале ис­пользуют метод введения раствора колхицина в растение с помощью глазных пипеток с укороченным концом через основания листочков.

7)Обработка корней. Этот метод наиболее эффективен при ра­боте с пшеницей, просом и другими злаками, у которых верхушка малодоступна, а также при работе с гречихой, томатами и прочими культурами. В начале выкапывают молодые растения и отмывают корни, затем попеременно погружают на 12 ч то в слабый раствор колхицина, то в проточную воду для снижения повреждения корней. Концентрация раствора - 0,0125-0,4%, экспозиция - 24-144 ч.

8)Обработка взрослых растений. Суть метода заключается в том, что оставляют несколько побегов, на которых обрабатывают все точки роста. Концентрация раствора выше обычного (0,2-1%). Обра­ботку можно проводить, нагибая побеги и погружая их в раствор. При этом используют капельный метод, тампоны и желатиновые кап­сулы, метод инъекций и др.

9)Обработка путем погружения побега. На побеге делают не­большой надрез на 1-2 см ниже верхушки и погружают надрезанную часть в пробирку с раствором. Все почки на расстоянии не менее 4-5 см от обработанной части удаляют.

10)Обработка цветоносных побегов. Суть метода в том, что колхицин вводят в растение через стебель в период заложения и фор­мирования спорогенной ткани. Применяется метод у двулетних куль­тур (сахарная и кормовая свёкла, турнепс). Обработка цветоносных побегов во второй год жизни ускоряет работу, т. к. позволяет полу­чить тетраплоидные семена в первый год жизни. Например, у свёклы надрезают до половины у основания цветоносный побег (длиной 10­12 см) и расщепляют его. Отщепленный конец погружают в пробирку с 0,01%-ным раствором колхицина. В результате образуются дипло­идные яйцеклетки и пыльца. Таким путём удаётся получить до 40­50% тетраплоидных семян.

4Анеуплоиды, в частности нуллисомики (2n - 2), моносомики (2n - 1), трисомики (2n + 1) и другие, в настоящее время применяют в генети­ческом анализе, результаты которого используют в практической се­лекции. Например, у мягкой пшеницы после создания серий моносомных и трисомных линий стало возможно определять генный состав её хромосом, а также локализовать любой ген и осуществить замещение одних хромосом другими. Это было проведено Э. Сирсом у сорта Чайниз Спринг (21 моносомная линия). В результате этих работ га­плоидный набор мягкой пшеницы был разбит на семь гомеологиче- ских групп, по три хромосомы в каждой группе в зависимости от их принадлежности к геномам А, В и D. Полные ряды моносомиков и трисомиков созданы у пшеницы, овса и некоторых других культур. Серии моносомных и трисомных линий используются для изучения наследования различных признаков с учётом генетического вклада каждой отдельной хромосомы. Благодаря таким исследованиям от­крывается возможность манипулировать с отдельными хромосомами или их фрагментами (генетическая инженерия). Например, сорту яро­вой пшеницы Тетчер, у которого в хромосомах III, XIII, XIX содер­жится по одному гену устойчивости к бурой ржавчине, путём заме­щения хромосом X, XX удалось добавить ещё два гена резистентно­сти. У диплоидных культур создают серии трисомиков.

5.Гаплоиды - это особи обычно диплоидных или аллополиплоид- ных видов, в соматических клетках которых содержится в два раза меньше хромосом, чем у исходных форм, причём из каждой пары го­мологичных хромосом представлена только одна хромосома. Гаплои- дия применяется для изучения генетики и эволюции растений. С её помощью определяют геномный состав видов и уточняют их таксо­номическое положение, исследуют влияние дозы геномов в полипло­идных рядах, выясняют происхождение и генетические причины апомиксиса.

На явлении гаплоидии основаны методы получения из гаплоидов гомозиготных диплоидных линий, а также удачных рекомбинаций генов при комбинационной селекции. Впервые на перспективность применения гаплоидов для решения селекционных задач указал в 1929 г. Г.Д. Карпеченко. Поскольку в гаметах желательное сочетание генов бывает чаще, чем в зиготах, то проще и быстрее получить гомо­зиготную форму с нужным сочетанием признаков путём прямого удвоения хромосом у гаплоидов. Например, для получения всех воз­можных типов гомозиготных линий на основе перекомбинации семи пар независимых генов необходимо перевести на диплоидный уровень только 128 гамет гибридов F₁ (2⁷). На диплоидном уровне для до­стижения такого же результата потребуется уже не менее 16384 рас­тений F₂ (4⁷). То есть эффективность комбинационной селекции во много раз возрастает при разработке способа массового выделения гаплоидов для последующего перевода их на диплоидный уровень. Путём удвоения числа хромосом у гаплоидов можно сразу создать гомозиготные линии (у перекрёстноопыляющихся культур на выде­ление их требуется до 7-10 лет).

Для экспериментального получения гаплоидных растений также используют следующие методы: 1) культивирование пыльников и микроспор в стерильных условиях на питательной среде; 2) отбор близнецов; 3) межвидовые скрещивания; 4) радиологический метод; 5) гибридизация на разных уровнях плоидности.

Наиболее перспективными методами являются культивирование пыльников и пыльцы (микроспор) в стерильных условиях (in vitro).

С. Гуха и С. Махашвари в 1964 г. впервые обнаружили в культу­ре in vitro пыльников дурмана (Datura) эмбриоподобные структуры.

Через два года из такой структуры было получено гаплоидное расте­ние. Авторы указали на происхождение этого растения из гаплоидно­го пыльцевого зерна. Большой вклад в разработку метода массового получения гаплоидов внёс Дж. П. Нич с сотрудниками. Разработанный ими в 1972 г. метод лёг в основу использования культуры пыльников для вызывания in vitro андрогенеза у растений. Г. Мельхерс (1976) наметил новые пути массового получения гаплоидов в селекции рас­тений и внёс предложение соединить метод культуры пыльников с общепринятыми методами селекции.

Для получения дигаплоидных растений в процессе селекции вна­чале проводят скрещивания. Из пыльников растений F₁ получают га­плоиды, удваивают у них число хромосом с помощью колхицина. Потомства полученных дигаплоидных растений оценивают в поле в F₃ и F4 а лучшие линии проходят испытания на продуктивность в Fg- F₈.

При культуре пыльников редко удаётся полностью исключить размножение диплоидных клеток ткани пыльника и возникновение из них диплоидных эмбрионов. Поэтому более перспективно получение гаплоидов из изолированной пыльцы.

В Китае с помощью культуры пыльников удалось вывести корот- костебельный, скороспелый и урожайный сорт риса. В России этим методом были получены перспективные формы ячменя, тритикале, табака, картофеля и ряда других сельскохозяйственных растений.

В селекционно-генетическом институте (г. Одесса) создано два перспективных сорта ярового ячменя: Исток и Одесский 115. Первый из них вывели за 4 года вместо обычных 8-12 лет.

На основе андрогенной гаплоидии можно за одно поколение осуществить перевод отцовского ядра в цитоплазму материнской формы. Это имеет большое значение в селекции кукурузы на гетеро­зис при создании андростерильных линий, на что обычно затрачива­ется 5-7 лет.

П. А. Баранов, Н.П. Дубинин и М.Н. Хаджинов в 1955 г. предло­жили для быстрого перевода самоопылённых линий кукурузы на сте­рильную основу использовать явление андрогенеза.

Перевод ядра отцовской формы в стерильную цитоплазму мате­ринской формы был осуществлён в 1963 г. Т.С. Чалыком в России и С. Чейзом в США путём скрещивания маркированных линий.

Литература:

1. Сагалбеков Е.У., Зотова Л.П. Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур, Астана: Издательство Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина, 2015.-258с.

2. Таранухо Г.И. Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур: Учебник. – Минск: ИВЦ Минфина, 2009. – 420 с.

3. Ведров Н.Г. Селекция и семеноводство полевых культур: учеб. пособие. - Красноярск, 2008.-300 с.

4. Пыльнев В.В., Коновалов Ю.Б., Березкин А.Н. Практикум по селекции и семеноводству полевых культур: Учебное пособие (практикум). – М.: «КолоС», 2008. – 404 с.

5. Малицкая Н.В., Сыздыкова Г.Т., Аужанова М.А. Семеноводство зерновых культур в Северном Казахстане: курс лекций. - Петропавловск: СКГУ им. М. Козыбаева, 2016.-90с.