Использование новых технологий в создании генетической рекомбинации организмов (генотерапия, клеточная терапия).

рекомбинантная структура (англ. Recombinant structure) — гибридная (англ. recombination — рекомбинация) нуклеиновая кислота (ДНК или РНК) или белок, полученные в результате объединения in vitro чужеродных фрагментов и содержащие новые сочетания последовательностей нуклеотидов или аминокислот соответственно.

Описание

Рекомбинация — процесс обмена генетическим материалом путем разрыва и соединения разных молекул нуклеиновых кислот, т. е. перераспределение генетического материала, приводящее к созданию новых комбинаций генов. В естественных условиях рекомбинация у эукариот — обмен участками хромосом в процессе клеточного деления. У прокариот рекомбинация осуществляется при передаче ДНК путем конъюгации, трансформации или трансдукции, либо в процессе обмена участками вирусных геномов. Методы генной инженерии значительно расширили возможности рекомбинационных обменов и позволяют, в отличие от естественной рекомбинации, получать гибридные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие практически любые чужеродные фрагменты. Суть этой технологии заключается в соединении фрагментов ДНК in vitro с последующим введением рекомбинантных генетических структур в живую клетку. Генно-инженерные манипуляции стали возможны после открытия рестриктаз (ферментов, разрезающих ДНК строго в определенных участках) и лигаз (ферментов, сшивающих двухцепочечные фрагменты ДНК). С помощью этих ферментов получают определенные фрагменты ДНК и соединяют их в единое целое. Для такого искусственного объединения безразлично происхождение ДНК, между тем как в природе объединению генетической информации чужеродных организмов препятствуют механизмы межвидовых барьеров. Первую рекомбинантную молекулу ДНК, состоящую из фрагмента ДНК вируса OB40 и бактериофага с галактозным опероном E. coli, в 1972 г. создали Берг с сотрудниками.

Техника генной инженерии включает несколько последовательных процедур:

1. выделение нужного (целевого) гена;
2. встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);
3. введение вектора в организм-реципиент;
4. идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.

Белки, полученные генно-инженерным способом, т. е. транслируемые с рекомбинантных ДНК, также называются рекомбинантными. Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное воздействие на развитие современной биологии, позволив решать многие теоретические задачи, например, определять функции белков, изучать механизмы егуляции экспрессии генов. С помощью технологии создания рекомбинантных структур были открыты и изучены: мозаичное строение генов у высших организмов, транспозоны бактерий и мобильные диспергированные элементы высших организмов, онкогены и т. д. Рекомбинантные структуры нашли широкое применение в промышленной биотехнологии, включая производство ферментов, гормонов, интерферонов, антибиотиков, витаминов и многих других продуктов для фармакологии и пищевой промышленности, на получение которых ранее затрачивалось много времени и средств. Методом рекомбинантных ДНК были получены генетически модифицированные растения и трансгенные животные, обладающие новыми полезными для человека свойствами. Рекомбинантные структуры используются в медицине в методах генной терапии, диагностике и создании рекомбинантных вакцин.

28.Генная диагностика и генная терапия. Схема генной коррекции.

Принципы генной терапии: в зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту. В настоящее время в большинстве допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии используется именно этот подход.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний (муковисцидоз, рак легких).

Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола. Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционально активен данный ген. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы коррекции на биохимическом уровне.

Используя культуры клеток, можно разработать систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако проверка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных моделях соответствующих наследственных болезней у животных. Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии являются важнейшей предпосылкой для разрешения клинических испытаний.

Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию последовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro) и, что особенно важно, in vivo на животных - биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний.

29. Генетическое тестирование. Генная и клеточная терапия.

Генетический тестпредполагает исследование образца клеток ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) на наличие атипичных генов, а также анализ количества, расположения и особенностей хромосом. Тестирование может быть выполнено на образцах крови, спермы, мочи, слюны, стула, тканей тела, кости, или волос.

Все наследуют половину своей генетической информации от матери и другую половину от отца. Гены, одни или в комбинации, определяют, какие особенности (генетические черты) человек наследует от своих родителей, например, группа крови, цвет волос, цвет глаз и другие детали, включая риски развития венерических заболеваний. Определенные изменения в генах или хромосомах могут вызывать медицинские проблемы. Генетический тест проводится для:

· Выявления семейной истории определенной болезни. Информация, полученная в результате данного теста, поможет паре в принятии решения относительно беременности.

· Выявления нарушений у зародыша, таких как синдром Дауна (предродовое тестирование). Информация, полученная в результате данного теста, поможет паре в принятии решения относительно беременности.

· Проверки наличия различных нарушений обмена веществ, например фенилкетонурии. Информация, полученная в результате данного теста, поможет подобрать необходимое лечение для гарантии оптимальных результатов.

· Проверки наличия генетических изменений, которые увеличивают риск развития рака молочной железы или болезни Хантингтона.

· Проверки наличия генетических изменений, которые могут усилить риск развития ВИЧ или раковых образований.

Образец клеток зародыша: для этого типа тестирования, используется амниоцентез (пункция плодного пузыря) или проба ворсинчатого хориона.

Болезненность анализов:при взятии крови, пациент может испытывать дискомфорт. Болезненность зависит от навыков медсестры и индивидуальной чувствительности. Взятие слюны, мочи, или спермы не вызывает дискомфорта.

Риски: существует очень небольшой риск осложнений этого анализа – образование маленького ушиба на участке прокола. В результате взятия анализа крови, может возникнуть воспаление участка прокола или образование ушиба. Безостановочное кровотечение может быть результатом приема варфарина или аналогичных препаратов. В данном случае, обратитесь к врачу. Рисков, связанных со сбором ДНК из слюны, мочи, или спермы, замечено не было.

Другие факторы:информация, полученная вследствие генетического теста, может повлиять на вашу жизнь и жизнь вашей семьи разными способами, включая:

· Психологические результаты. Эмоции, которые вы можете испытать, при получении информации о серьезных заболеваниях, могут привести к депрессии и подавленному состоянию. Эта информация может также повлиять на ваши отношения с партнером и другими членами семьи. До прохождения генетического тестирования рекомендуется обратиться за генетической консультацией.

· Выбор терапии. При положительном результате на определенный ген заболевания, вы можете приступить к профилактической терапии, чтобы уменьшать воздействие или тяжесть заболевания.

· Решение о беременности. Констатация того факта, что зародыш подвержен генетической болезни может повлиять на решение, относительно беременности. Вы можете решиться на прерывание беременности или, возможно, измениться план родов. Если вы планировали рожать дома, то полученная информация может убедить вас в необходимости проведения родов в специальном учреждении.

· Индивидуальные проблемы. Поскольку генетическое тестирование дорогостоящая процедура, большинство людей, не может себе его позволить без помощи страховых компаний. Многие пациенты волнуются, что генетическая информация, к которой получит доступ страховая компания, будут каким-либо образом раскрыты. Результатыгенетический тест исследует образец клеток ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) на наличие атипичных генов, или анализирует количество расположение и особенности хромосом. Результаты генетического тестирования зависят от типа проведенного теста. Генетические тесты используются для:

· Диагностики генетических заболеваний.

· Получения информации, касательно потенциальных заболеваний в будущем.

· Определения особенностей организма по переносу заболеваний.

· Получения информации о тяжести унаследованного заболевания.

Переливание крови за неделю до прохождения генетического теста может повлиять на точность результатов. Информация, полученная благодаря генетическому тесту, может оказать глубокое влияние на вашу жизнь, вы можете записаться на консультацию к врачу-генетику или консультанту по генетическим вопросам. Эти специалисты помогут вам понять риск развития генетических заболеваний, таких как серповидно-клеточная болезнь, кистозный фиброз, или гемофилия. Данные специалисты помогут вам принять правильные объективные решения. 1. Результаты генетических тестов – конфиденциальная информация и эта конфиденциальность должна быть соблюдена, а доступ к ней ограничен. 2. Эмбриональный генетический тест может выявить серьезное заболевание или нарушения, которые могут повлиять на вашу жизнь и жизнь вашего ребенка. 3.Кариотип может использоваться для исследования размеров, формы и числа хромосом. Дополнительные, недостающие или атипичные позиции частиц хромосомы могут вызывать проблемы роста, развития и функций организма. 4.Генетический тест иногда может показывать непреднамеренную информацию, например информацию об отцовстве. 5. Для получения информации, касательно риска развития рака молочной железы, проводится BRCA тест. 6. Обнаружение генетического заболевания, которое не вызывает текущих симптомов, может повлиять на возможность трудоустройства в будущем, а также может повлиять на выбор страховой компании. 7. ДНК-генотипоскопия используется для определения отцовства, помощи при раскрытии преступлений и опознании трупов. ДНК-генотипоскопия более точный анализ, нежели запись зубной формулы, группа крови и традиционные отпечатки пальцев.

30.Периоды онтогенеза человека. Пренатальное и постнатальное развитие.

Онтогенез человека делится на несколько крупных пе­риодов, которые свойственны развитию всех многоклеточных существ и особенно высших животных, сходных с человеком.
Прежде всего это эмбриогенез, т. е. тот период развития,который проходит у человека в утробе матери под защитой спе­циального барьерного органа — плаценты. В свою очередь эмб­риогенез, длящийся 9 мес , состоит из нескольких принци­пиальных этапов. Первый этап связан с оплодотворением, т. е.с самим фактом встречи родительских половых клеток. В это время зародышевые клетки подвержены влиянию естественногоотбора, так как далеко не все родительские клетки способны к дальнейшему развитию. Второй этап, с которого начинается эмбриогенез, — это превращение одной клетки — оплодотворен­ного яйца — в многоклеточный организм (дробление). Третий этап связан с началом дифференциации (специализации) клеток в организме и знаменуется появлением в нем трех первичных типов тканей. При этом в зародыше происходит перемещение клеточных пластов, а затем начинается этап органогенеза, т. е. закладка и образование различных органов и систем организма, характеризуемый сложными явлениями дифференциации кле­ток и объединением их в структуры. К двум месяцам развития складывается защитная система материнского организма — плацента, которая в дальнейшем и питает, и защищает разви­вающийся плод. В остальные семь месяцев развития человекапод защитой плаценты его органы приобретают функциональ­ную активность и быстро растут.
Значительным и драматичным для человеческого организ­ма является появление на свет, т. е. роды. Этот период также подвержен действию естественного отбора: не все зародыши благополучно доходят до конца эмбриогенеза и благополучно рождаются на свет. Далее наступает период детства, первым этапом которого является грудное вскармливание, когда в те­чение года особенно важным для человека является фактор питания. За это время происходят большие изменения в нерв­ной системе, созревают рецепторные системы (органы чувств), у ребенка закладывается интуитивный образ мира.
Следующий этап детства продолжается до шести-семи лет, когда окончательно созревает нервная система и вместе с ней способность к познанию окружающего мира. Увеличивается количество извилин в коре больших полушарий головного мозга, ребенок активно обучается, у него созревают условно-рефлекторные связи, т. е. в нервных связях запечатлевается жизненный опыт. Период детства сменяется препубертатным периодом, когда начинается и постепенно на протяжении не­скольких лет происходит созревание эндокринной системы, завершающееся наступлением юношеского периода, когда у под­ростка созревает репродуктивная система и половые гормоны включаются в эндокринную систему регуляции организма. Та­ким образом, нервная система и эндокринная система, т. е. две координирующие системы организма, окончательно созревают уже после рождения ребенка.
Все эти сложные процессы роста и созревания завершают­ся в среднем к 18 годам у женщин и к 20—21 году у мужчин, после чего следует длительный репродуктивный период — пе­риод мощной и согласованной работы всех систем организма. Это период воспроизведения, размножения и наивысшей рабо­тоспособности человеческого организма во всех отношениях.
После завершения репродуктивного периода (у женщин к 45—50 годам, у мужчин — несколько позже) начинается пе­реход к периоду старения, в котором принято выделять не­сколько стадий: климакс, пожилой возраст и долгожитель­ство, начинающееся в наше время после 90 лет.
Созревание, согласованная работа и последующее старение у людей различных рас приходятся на несколько разный астро­номический возраст. Вместе с тем возрастные характеристики связаны с состоянием окружающей человека среды. Ряд фак­торов среды обитания способствуют как более раннему созрева­нию, так и более раннему старению человеческого организма.
В онтогенезе человека, как и других живых существ, выде­ляют некоторые моменты, которые принято называть «критиче­скими», т. е. наиболее чувствительными к повреждающим фак­торам и условиям среды. Так, первый период онтогенеза, связан­ный с оплодотворением, размножением, перемещением клеток, органогенезом, безусловно, является критическим. Также и после рождения переход от каждого очередного периода онтогенеза к последующему связан с изменениями в управляющих систе­мах организма, следовательно, является критическим.
Все эти «чувствительные точки» являются возрастными мишенями для действия стрессорных факторов окружающей среды. По данным медицинской статистики соответствующие возрастные группы людей характеризуются повышенной забо­леваемостью и смертностью.
Человеческая популяция, для того чтобы воспроизводиться полноценно, должна подвергаться воздействию фильтра — есте­ственного отбора, который отметает, приводит к гибели наиме­нее жизнеспособные особи. Наиболее результативно действие естественного отбора происходит именно в те моменты, которые были названы критическими периодами. В частности, из всех оплодотворенных яйцеклеток у человека до конца эмбриональ­ного периода доходит не больше половины. Подверженными влиянию естественного отбора оказываются зародыши, несу­щие какие-либо летальные гены, а также те или иные уродства.