Типы исследования без генетического и с генетическим маркерами
| Исследование семьи | · Оценка риска повторения. · Оценка релевалентности семейных причинных факторов по сравнению с несемейными. · Нозологическая дифференциация между расстройствами. · Обнаружение косегрегирующих признаков и определение уязвимости. |
| High-Risk- (исследования высокого риска) | · Выявление преморбидных отклонений от нормы семейных расстройств. |
| Исследование близнецов | · Дифференциация и кватнтификация генетической составляющей в семейных факторах. · Оценка влияния взаимодействия ген – окружение. · Оценка релевалентности специфических факторов окружения. |
Продолжение таблицы 2.1.
| Исследование приёмных детей | · Оценка релевалентности специфических факторов, обусловленных окружающей средой. |
| Анализы сегрегации | · Констатация семейного или генетического типа передачи. |
| Типы наследования с генетическими маркерами | |
| Исследование ассоциаций | · Ассоциация между определёнными вариантами генов (аллелями) и заболеваниями. · Выявление неравновесия сцепления генов субцептибельности. |
| Исследование сцепления | · Косегрегация между генетической вариацией в локусе и заболеванием. · Локализация локусов. |
Для установления наследственной природы заболевания используется клинико-генеалогический метод (генеалогия – родословная). Один из первых этапов изучения генетики наследственного заболевания – выявление больного и составление его родословной.
Генетика интересует, имел ли кто-либо из родственников больного данное заболевание или оно появилось впервые. Такая постановка вопроса – непраздное любопытство. Необходимо выяснить, что проявилось у больного – новая мутация или старый ген. В зависимости от того или другого прогнозируется риск заболевания потомства не только у поражённого члена семьи, но и у его родственников. Если установлена мутация, то генетик пытается выявить факторы, обусловливающие её возникновение, для профилактики появления данного заболевания у других членов семьи.
Однако, что же появляется чаще при наследственном заболевании – новая мутация или старый ген?
Мужчины и женщины, их хромосомы. Как известно, во всех клетках человека (кроме половых) содержится 46 хромосом, или 23 пары, 22 из них называются аутосомами. Они обязательны во всех клетках как у мужчин, так и у женщин. Одна пара хромосом не одинакова у мужчин и женщин. У женщин эта пара состоит из двух Х-хромосом (ХХ), а у мужчин из Х и У-хромосом (ХУ).
Формы и размеры хромосом у человека различны. Каждая из низ имеет перетяжку (центромеру), которая делит хромосому на две части (плечи). В зависимости от расположения центромеры различают три типа хромосом:
· метацентрические – центромера расположена в центре хромосомы,
оба плеча хромосомы одинаковы по длине;
· субметацентрические – центромера расположена не в центре
хромосомы, одно плечо несколько больше другого;
· акроцентрические – центромера расположена на конце хромосомы,
одно плечо длинное, а другое очень короткое.
Поскольку размеры хромосом человека различны – есть очень большие и очень маленькие – их объединяют условно в семь групп. В каждую группу входят хромосомы, подобные по форме и размеру.
До последнего времени было довольно трудно идентифицировать хромосомы внутри каждой группы. Сегодня цитогенетики располагают целой совокупностью методик, с помощью которых возможны не только полная идентификация гомологичных и одногрупповых хромосом, но и детальное исследование структуры отдельных хромосом и их фрагментов для изучения, как нормального строения, так и обнаружения тонких хромосомных мутаций.
Успехи последних лет в технике фиксации и окрашивания клеток сделали возможным цитологическое изучение клеток человека наряду с клетками других млекопитающих. Благодаря этому в 1956году было обнаружено, что число хромосом у человека равно 46,а не 48, как считали в течение 30 или даже более лет.
Хотя число хромосом у человека обычно равно 46, известно несколько редких случаев отклонения этого числа от нормы. Как правило, это сопровождается изменениями фенотипа. Явление изменения числа хромосом называют плоидией. Индивидуум может быть полиплоидным, т.е. иметь один и больше полных наборов хромосом сверх нормы, или же может иметь 1 – 2 добавочные хромосомы (т.е. всего соответственно 47 или 48).У мальчика с сильной умственной отсталостью был обнаружен триплоидный набор хромосом, т.е. общее число хромосом было равно 69. Среди них было 66 аутосом, две Х-хромосомы и одна У-хромосома. По-видимому, зигота, в данном случае, образовалась либо из обычной гаплоидной яйцеклетки, оплодотворённой необычным диплоидным сперматозоидом, либо из диплоидной яйцеклетки, оплодотворённой гаплоидным сперматозоидом.
Теперь известно много случаев, когда у людей наблюдалось увеличение или уменьшение числа хромосом на единицу; и те, и другие случаи вызываются, по-видимому, явлением не расхождения. Это явление объясняют неспособностью пары гомологичных хромосом разделиться в процессе редукционного деления. Например, две Х-хромосомы могут остаться неразделёнными и войти в ядро яйцеклетки. При этом в полярных тельцах Х-хромосом не будет вовсе. Возможно, также, что две спаренные Х-хромосомы отойдут к полярному тельцу, при этом пронуклеус яйцеклетки будет лишён Х-хромосом. Не расхождение ХУ-хромосом у мужчин приводит к образованию сперматозоидов, одновременно несущих как Х, так и У-хромосому, или же сперматозоидов, лишённых и той, и другой хромосом.
Цитогенетические исследования помогли выяснить происхождение наиболее тяжёлых врождённых заболеваний – болезнь (синдром) Дауна, синдром Клайнфельтера, синдром Тернера.
Ни одна семейная пара не хотела бы иметь ребёнка с наследственным заболеванием. Может ли генетика помочь таким родителям? Да, может. В разработке методов профилактики генных и хромосомных заболеваний (аномалий) современная генетика достигла больших успехов. Методом амниоцентеза, благодаря биохимическим анализам и изучению хромосомного набора у клеток, слущивающихся с плода и находящихся в околоплодной жидкости, можно идентифицировать около 100 генных и практически все хромосомные отклонения у развивающегося эмбриона в период до 18 недель беременности.
Метод амниоцентеза успешно используется в Японии. В этой стране в обязательном порядке и бесплатно для забеременевших пациенток старше 35 лет (уже ясно, почему старше 35), а также для женщин, уже имеющих детей с отклонениями, либо происходящих из семей с наследственно неполноценными родственниками, делается анализ околоплодной жидкости и находящихся в ней клеток от плода. При наличии наследственного заболевания у эмбриона пациенткам представляется возможность самим решать, рожать ребёнка или нет. Такой подход позволяет в значительной степени снизить рождаемость наследственно неполноценных детей и, в итоге, ограждает семью от трагедии, а общество от необходимости организации специальных домов для детей-инвалидов.
Метод амниоцентеза – относительно трудоёмкая и дорогостоящая процедура. Однако экономисты США подсчитали, что стоимость анализа для 900 женщин намного ниже стоимости прижизненной госпитализации одного больного, которая оценивается более чем в 100 тыс. долларов. Ежегодно в США рождается около 4 тыс. детей с наследственными болезнями и их госпитализация обходится в 1,5 млрд. долларов в год.
Пренатальная диагностика плода осуществляется с помощью различных методов исследования: хориона, амниотической жидкости, крови плода и др. Её появлению в конце 60-х гг. способствовало развитие генетики клеток, позволяющее создать метод определения пола плода, основанный на исследовании амниотической жидкости, получаемой посредством пункции околоплодного пузыря (амниоцентеза). Амниоцентез осуществляют с 16 недели беременности (из-за возможности технических осложнений и опасности травматизации плода иглой). В настоящее время, поскольку вся процедура проводится по ультразвуковым контролем, амниотическую жидкость можно получать, начиная с 7 недель. Количество извлекаемой амниотической жидкости (1-40 мл) зависит от срока беременности и задач лабораторной диагностики (рис. 2.1).
Рис. 2.1.Схема проведения амниоцентеза. Рис.2.2. Схема проведения биопсии хориона
1. Плод 1. Плодный пузырь
2. Стенка матки 2. Стенка матки
3. Шприц для аспирации амниотической 3. Ворсинки хориона
жидкости. 4. Эпителий матки.
4. Амниотическая жидкость 5.Щипцы для биопсии.
5. Влагалище
Кровь плода получают с помощью кордоцентезаили пункции сосудов пуповины. Наиболее ранним гестационным возрастом плода, при котором извлечение его крови в количестве 1 мл не ведёт к осложнениям, является 16 неделя беременности. Поскольку в большинстве случаев требуется большее количество крови – манипуляцию проводят в более поздние сроки, вплоть до 27 недели беременности. При этом количество аспирированной крови колеблется от 1 до 5 мл, как правило, не приводя к отрицательным последствиям.
С конца 70-х годов применяется ещё один способ получения ткани в I триместре беременности – биопсия ворсин хориона.Взятие ткани хориона осуществляется различными способами (рис. 2.2).
Последние годы основными из них являются трансцервикальный метод, с помощью биопсийных щипцов малого диаметра (обычно 1,7 мм) или специального пластикового катетера – трофокана и трансабдоминальная аспирация хориона с использованием иглы и шприца. Проведение процедуры с целью получения хориональной ткани возможно после 7 недели беременности, однако оптимальными сроками её проведения является 8-10 недели беременности. Перед манипуляцией требуется ультразвуковое исследование для характеристики хориона, уточнения срока беременности, исключения возможных отклонений в её развитии. Количество материала зависит от метода его получения и колеблется от 1 до 35 мл.
Имеются и другие, получившие меньшее распространение способы взятия плодного материала, применяемые для определения пола плода: биопсия кожи плода, аспирация крови плода посредством пункции плаценты и др.
Методы исследования полученного плодного материала с целью установления пола плода основывается на установлении наличия или отсутствия У-хромосомы, как фактора, определяющего пол у человека. Наибольшее распространение для выявление У-хромосомы получил метод анализа метафазных хромосом (кариотипирование), обычно в сочетании с разработанным методом дифференциальной окраски препаратов хромосом (флюоресцентная гибридизация in sity - FISH). Другой, разработанный за последнее десятилетие метод – полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данный метод позволяет быстро и специфично проводить анализ крайне малых количеств ДНК. При использовании ПЦР можно с помощью фермента Тад-полимеразы увеличить (амплицировать) количество ДНК, содержащееся в одной или нескольких клетках, до количества, достаточного для пренатальной диагностики. Применив соответствующие праймеры (синтезированные искусственно участки ДНК, ограничивающие амплифицируемый регион), этим методом можно быстро установить наличие или отсутствие последовательностей ДНК, характерных для У-хромосомы.
Учёные США подсчитали, что более 5% населения страны имеют наследственные отклонения и нуждаются в генетической консультации.
А что же делать, если больной ребёнок все-таки родился? Здесь на помощь приходит генетика. Установлено, что некоторые наследственные заболевания можно «лечить» на уровне фенотипа. В настоящее время возникло целое направление в генетике – «лечение» фенилкетонурии. Но как провести раннюю диагностику наследственного заболевания у новорожденного, если внешне у него не видно никаких отклонений от нормы? В этом случае медико-генетическая служба предлагает ряд скринирующих (скрининг - просеивание) методик. В настоящее время скринингу поддаются около 20 наследственных болезней у новорожденных. С этой целью у последних берётся моча и кровь (из пятки). Современное состояние генетики позволяет проводить скрининг одной пробы на разные наследственные заболевания в разных центрах, при этом для анализа высылается капля крови на бумаге в конверте.
Близнецовый метод
До открытия близнецового метода суждение о степени наследования того или иного признака основывалось на сопоставлении внешнего облика и черт характера членов семьи в нескольких поколениях. Такой генеалогический подход имеет очень ограниченное значение, поскольку требует слишком длительного времени наблюдения, либо подробных семейных хроник, которые составлялись только для ограниченного числа наиболее знатных семей. Появление близнецового метода, оценки соотносительной роли наследственности и среды в формировании личности позволило в течение относительно короткого промежутка времени получить теоретически и практически важные результаты, которые нашли широкое применение в практической деятельности.
Теоретические основы близнецового метода были заложены английским исследователем Ф. Гальтоном более 100 лет(1876) назад при попытке решения вопроса о степени наследования таланта. Целесообразность исследования вытекала из жизненных наблюдений, показывающих, что в некоторых семьях в нескольких поколениях проявляются незаурядные таланты. Так, среди родственников выдающегося композитора Иоганна Себастьяна Баха было более 50 музыкантов, 20 из которых заслуженно считаются знаменитыми. Первые музыкальные таланты семьи проявились в 1550 г. и прослежены до 1800г. Богата музыкальными талантами семья Моцарта, математическими – семья Бернулли, литературными – семья Дюма. Исследования Гальтона показали, что, используя явление близнецовости, можно оценить степень наследования свойств в значительно короткие сроки.
У обычного человека внешний облик, манера поведения и все особенности личности, которые позволяют занять ему свою позицию в алфавитном ряду «от А до Я», определяются биологами под общим термином «фенотип», возникают в результате сочетания наследственных (генетически детерминированных) и средовых воздействий. Это хорошо известное положение можно записать формальным уравнением:
Ф ор =Н+С,
где: Ф ор – фенотип одиночнорожденного человека; Н – наследственные влияния; С – средовые влияния. Поскольку и Н и С – неизвестные, уравнение не решается и не даёт ничего нового, по сравнению со словесной формой описания общей биологической закономерности.
Фенотипы братьев и сестёр одной семьи, так же, как и фенотипы двух дизиготных близнецов (А и Б), которые являются одновременно рождёнными братьями или сёстрами, отличаются в связи с разной наследственностью и неодинаковыми средовыми влияниями. Это положение можно записать следующим образом:
Ф А = Н А +С А и
Ф Б = Н Б +С Б
Такая система уравнений также не даёт возможности оценить соотносительное влияние наследственности и среды, поскольку два уравнения содержат четыре неизвестных.
Иначе обстоит дело с парой монозиготных близнецов, которых можно рассматривать как один организм, разделившийся на две идентичные части на самых ранних этапах индивидуального развития. Каждый из двух монозиготных близнецов характеризуется одинаковой наследственностью, а средовые влияния могут быть практически идентичными, если дети растут в одной семье, либо - различными, если дети воспитываются в неодинаковых условиях. Фенотипы монозиготных близнецов (В и Г) можно описать следующими выражениями:
Ф В = Н В +С В и
Ф Г = Н В +С Г
Именно этот вариант, когда монозиготные близнецы растут в одинаковых условиях, случайные вариации которых по сути такие же, как и для дизиготных близнецов, даёт исследователям два уравнения с одним неизвестным, позволяя решить казалось бы неразрешимую задачу – количественно оценить соотносительное влияние наследственных и средовых факторов в формировании индивидуальных свойств личности.
Установлена математическая зависимость между частотой рождения двоен, троен, четверен. В Болгарии за период с 1881 по 1969 гг. двойни встречались один раз на 80 родов, тройни – один раз на 6000 родов (802), четверни – один раз на 540 000 родов (803).
В настоящее время установлено, что первое редукционное деление (мейоз) у девочки происходит в эмбриональный период (4-6 месяцев беременности матери), а второе редукционное деление и созревание яйцеклетки наступают в период полового созревания, что соответствует примерно 11-12 годам. Далее попеременно, то в правом яичнике, то в левом, созревает одна яйцеклетка в каждые 28-30 дней. Таким образом, одни клетки будут «ждать» второго редукционного деления 11-12 лет, а другие – 25 или даже 40 лет.
Однако на 100 женщин встречается одна, у которой созревают одновременно две и более яйцеклетки. Случаи рождения трёх-пяти близнецов не единичны; имеются факты рождения шести близнецов. Во всех этих случаях близнецы разнояйцовые. В некоторых случаях созревающая и оплодотворённая яйцеклетка может поделиться и так, что даст возможность образоваться двум и более совершенно одинаковым (идентичным, однояйцовым) организмам-близнецам. Если разнояйцовые близнецы могут быть одно- или разнополыми, то однояйцовые бывают только однополыми.
Частота рождения близнецов зависит от разных причин, в том числе, и от возраста матери и числа её предшествующих родов (табл. 2.2).
Таблица 2.2