Теломеры и теломерный гетерохроматин
Концепция теломеры. Три группы фактов, полученных к началу1980-х годов, свидетельствовали о наличии на концах хромосом особых структур:
1. Цитологи, изучавшие кариотипы растений или животных, отмечали, что морфология отдельных хромосом и наборы хромосом в целом являются постоянными. Если бы была возможность хромосомам склеиваться .конец - в конец., такого постоянства бы не было. Значит существует некая структура, запрещающая объединение теломерных концов.
2. Г.Дж. Меллер в 1927 году открыл возможность получения мутаций в результате облучения клеток дрозофилы рентгеновскими лучами. При этом мутации могут быть точковыми или сопровождаться перестройками хромосом (инверсиями, транслокациями, делециями и дупликациями). Перестройки образуются в результате разрывов в различных участках хромосом под действием излучения и последующего воссоединения фрагментов в новом порядке. Исследуя закономерности образования хромосомных перестроек Г. Меллер в 1932 году пришел к двум важным выводам о поведении наиболее дистальных частей нормальных хромосом:
1. Искусственно образовавшиеся концы фрагментов хромосом объединяются только с такими же искусственно образовавшимися и никогда - с концевыми фрагментами, существующими в нормальных хромосомах.
2. В свою очередь концевые участки нормальных хромосом в результате облучения никогда не перемещаются во внутренние районы хромосом. Для объяснения результатов этих наблюдений Меллер предположил, что участки хромосом (или гены, как он их называл), расположенные во внутренних районах хромосом, обладают свойством биполярности., т.е. они могут соединяться с другими фрагментами каждым из двух своих свободных концов. Тот ген (или фрагмент хромосомы), который в нормальной хромосоме расположен на самом ее конце, по мнению Меллера, униполярен, т.е. способен к объединению только с той стороны, которая обращена к внутренней части хромосомы. Меллер предположил, что этот концевой униполярный ген необходим для особой функции, запечатывания конца хромосомы. Такой ген был назван специальным термином - теломерой (по-гречески телос - означает конец, мерос - часть). Барбара Макклинток в 1941 году на основании полученных ею результатов по индукции хромосомных перестроек у кукурузы пришла к тем же выводам, что и Меллер. Более того, она постулировала, что пассивность теломер в объединении с другими участками хромосом играет исключительно важную роль, поскольку предотвращает склеивание хромосом конец - в конец, а это в свою очередь, способствует сохранению их индивидуальности и всего кариотипа в целом.
3. После открытия структуры ДНК и механизмов ее репликации А.М. Оловникова в России, заинтересовала загадка организации репликации на конце молекулы ДНК. Дело в том, что каждая хромосома содержит единственную непрерывную молекулу ДНК, и концы этой молекулы соответствуют концам хромосомы. В соответствии со стандартной модельюрепликации ДНК процесс удвоения отстающей цепи ДНК начинается с синтеза коротких РНК-праймеров, или затравок, с 3.-концов которых синтезируются отрезки ДНК - фрагменты Оказаки. Затем отрезок РНК удаляется, образовавшиеся бреши (гэпы) заполняется фрагментами ДНК. Последние синтезируются, используя в качестве праймеров 3-концы фрагментов Оказаки. Поскольку для крайнего гэпа нет праймера, вновь синтезированная цепь оказывается на 8-12 нуклеотидов (длина РНК-праймера) короче исходной. В результате, после каждого цикла репликации молекула ДНК должна становиться все короче: одна из четырёх цепей, образовавшихся в результате раунда репликации стала короче на 8-12 п.н., т.е. на одном из концов хромосомы средняя длина четырёх цепей ДНК уменьшилась на 2- 3 п.н.
Поэтому А.М. Оловников пришел к выводу, что если в клетке нет особых механизмов, компенсирующих эти потери нуклеотидов с каждого конца нити ДНК, то хромосома начнет сокращаться: сначала должны исчезнуть теломерные районы, затем ближайшие к теломерам гены, потом более удаленные гены и т.д. Очевидно, что этот процесс должен, в конце концов, привести к гибели клетки. Действительно, у клеток, растущих в культуре (in vitro), есть лимит на число делений. Американским ученым Л. Хейфликом в 1965 году было показано, что если для культивирования взять клетки у новорожденных, они могут пройти 80-90 делений; клетки, взятые у 70-летних, делятся только 20-30 раз. Ограничение на число клеточных делений называют барьером Хейфлика. Обычно клетки не преодолевают барьер из 2-90 делений, по мнению Хейфлика . 50+10. А.М. Оловников в 1971 году предложил следующую формулу для расчета продолжительности жизни любого клона клеток in vitro: ( M), lm lt T = k - где T- срок предстоящей жизни клеток К коэффициент корреляции между сроком жизни клона клеток и числом репликаций ДНК lt . длина теломерного участка lm длина фрагмента ДНК, утрачиваемого в ходе каждого цикла репликации M . число уже прошедших репликаций. Таким образом, Оловников напрямую связал срок жизни клеточных клонов с длиной теломерной ДНК. О том, что укорочение концевого фрагмента ДНК реально, свидетельствуют результаты следующего опыта. При мобилизации перемещений транспозона из теломерного района X- хромосомы дрозофилы в последнем обнаружены терминальные делеции, удаляющие наиболее дистальные последовательности ДНК. В последующих поколениях в линиях с такими делециями монотонно уменьшается длина концевых фрагментов ДНК (от теломеры к центромере) со скоростью 50-100 (в среднем 75) пар нуклеотидов за одно поколение. Полагают, что размер утрачиваемого фрагмента коррелирует с размером октонуклеотида РНК-праймера, инициирующего синтез фрагментов Оказаки при репликации ДНК. Если учесть, что клетки полового пути у этого вида в течение одного поколения делятся примерно 35 раз, совпадение расчетной длины фрагментов, утерянных за одно поколение, и экпериментальных данных оказалось поразительным. В нормальных же хромосомах, в которых теломерыприсутствуют, укорочение длины молекулы ДНК не происходит.
Строение теломер. Молекулярно-генетическое изучение теломер осложняется тем, что концентрация теломерной ДНК в ядрах эукариот очень низка (8 теломер в 1,7ґ108 п.н. генома дрозофилы или 46 теломер в 3ґ109 п.н. генома человека. Подход к решению проблемы выделения теломерной ДНК был найден неожиданно. Цитологи, изучавшие развитие простейших одноклеточных животных из класса Ciliata, таких как например всем известная инфузория туфелька, обнаружили у каждого организма по два ядра - микронуклеус и макронуклеус. Микронуклеус является покоящимся ядром, в котором хромосомы находятся в компактном состоянии, и служащим для передачи наследственного материала от одного поколения другому. Другое дело - макронуклеус. Это трофическое ядро. Хромосомы там находятся в активном состоянии - на них синтезируется РНК, кодирующая белки, необходимые для роста и жизнедеятельности этого одноклеточного организма. На начальных этапах развития инфузории хромосомный материал макронуклеуса испытывает серию сложных превращений. Сначала хромосомы политенизируются, т.е. каждая хромосома реплицируется примерно десять раз и все вновь образованные хромосомы остаются тесно связанными друг с другом, образуя пучек хромосом или, как в таких случаях говорят, политенную хромосому с характерным рисунком темных хромомеров и светлых межхромомерных участков. Затем политенная хромосома как бы разрезается поперек на тысячи долек, в каждой из которых находится один или несколько хромомеров. Каждая долька обтянута особой белковой оболочкой, формируя пузырек. Таким образом, на этой стадии развития в созревающем макронуклеусе находятся тысячи пузырьков, в каждом из которых находится один или несколько хромомеров. В пузырьках происходит .созревание. наследственного материала: из фрагмента хромосомы удаляется и переваривается вся ДНК, не имеющая прямого отношения к кодированию наследственной информации, например, межгенные фрагменты, внутренние участки генов, не кодирующие белки (интроны), а так же мобильные элементы генома. Затем пузырьки разрываются, и их содержимое выходит в полость макронуклеуса, который превращается по образному выражению Д.М. Прескотта - исследователя этих процессов - в .мешок с генами.. И наконец, самое важное: к каждому из этих генов присоединяется по одной теломерной последовательности с каждого конца. В итоге всех этих процессов в макронуклеусе в общей сложности присутствует несколько миллионов теломер. Наличие мешка с генами, в котором находятся только индивидуальные гены, предоставляет уникальные возможности для их выделения, последующего клонирования (т.е. размножения многих миллионов идентичных копий гена в клетках живых бактерий или дрожжей) и последующего биохимического анализа . В 1978 г. Е. Блакберн и Дж. Голл, выделив из макронуклеуса инфузории тетрахимены (.мешка с генами.) фрагмент ДНК длиной 22 т.п.н., содержащий два сцепленных друг с другом гена рибосомной РНК и применив только еще набиравшую популярность методику определения последовательностей нуклеотидов в молекулах ДНК, установили, что на обоих концах этой пары генов находится относительно простая последовательность из цитидина (С) и аденозина (А), а во второй цепи ДНК, соответственно гуанидина (G) и тимидина (Т): т.е. на концах генов была последовательность CCCCAA/GGGGTT, повторенная несколько раз подряд. У двух других видов, Stylonychia и Oxytricha как было показано несколько позже, они похожи: CCCCAAAA/GGGGTTTT. В последние годы с помощью различных биохимических методик теломеры были выделены из ДНК многих организмов. Оказалось, что у большинства видов животных и растений теломерные районы имеют в целом очень похожий тип строения. Как правило, в состав теломерного района входят два типа фрагментов: собственно конечная часть хромосомы (или теломерный концевой повтор - TR) и .последовательность, связанная с теломерой. (TAS), которые располагаются вглубь хромосомы. Несмотря на то, что молекулярная структура теломеры была к началу 1990- х годов, в основном расшифрована, проблема неполной репликации на концелинейной молекулы ДНК осталась. В последние несколько лет выяснилось, что природа выработала механизм удлинения (или элонгации) самого конца хромосомы - т.е. теломерного концевого повтора. Это связано с активностью особого фермента - теломеразы - рибонуклеопротеида, т.е. белка, содержащего в своем составе короткую молекулу РНК (примерно 150 нуклеотидов, среди которых 2 копии теломерного повтора).
Теломераза выполняет две функции:
1. Перед началом цикла репликации ДНК теломераза добавляет несколько копий теломерных повторов на 3. конец ДНК. После этого репликация идет в обычном порядке. На отстающей цепи синтезируются РНК-праймеры, при этом наиболее важно то, что самый концевой праймер синтезируется на теломерном повторе. После заполнения гэпов и завершения репликации остается незаполненным только участок РНК- праймера, синтезированного на теломерной последовательности. В результате дочерние цепи ДНК получаются той же длины, что и родительские цепи.
2. Нетрудно заметить, что часть нуклеотидов на 3 конце отстающей цепи все же не будет реплицироваться. Но эта неполная репликация произойдет в зоне теломерного повтора, что не причинит никакого вреда генам, расположенным рядом. Однако, через несколько циклов репликации теломерный повтор .растает. и недорепликация начнет затрагивать гены. Поэтому второй функцией теломеразы является постоянное наращивание G-нити. Теломераза имеет свою матричную молекулу РНК, с помощью которой фермент распознает теломерный повтор. Последовательность 5.- CAACCCCAA-3. в молекуле теломеразы спаривается с последовательностью теломерного повтора 5.-TTGGGG-3. Нуклеотиды ААС в РНК теломеразы остаются неспаренными, и на них достраиваются нуклеотиды TTG. Фермент перемещается на самый конец теломерной последовательности т.е. на всю длину TTGGGGTTG, и нуклеотиды AAC из молекулы теломеразы спариваются с TTG теломеры, после чего достраивается вся последовательность повтора.
Таким образом, очевидно, что конец хромосомы как бы .запечатан. особой ДНК-белковой структурой, которая позволяет нормально реплицироваться ДНК всей хромосомы. В последнее время накапливаются данные о том, что нарушения в механизме удлинениятеломерного повтора непосредственно связаны с формированием злокачественных новообразований, а также играют важную роль в процессе старения. Теломеры в клетках зародышевого пути, благодаря постоянно высокой активности теломеразы сохраняют нормальную длину. Однако, в соматических клетках, культивируемых in vitro, теломераза неактивна, и теломеры постоянно укорачиваются. Это и объясняет существование барьера Хейфлика. В раковых клетках, которые также являются соматическими, клеточные деления не прекращаются, и теломеры у них не укорачиваются. Оказалось, что почти во всех образцах опухолевых клеток, взятых как из культуры, так и из целого организма, активность теломеразы сохраняется на высоком уровне. Это обстоятельство позволило ученым пофантазировать на следующую тему: если бы удалось найти химический реагент, избирательно инактивирующий теломеразу, то при его применении опухолевые клетки быстро достигали бы барьера Хейфлика и погибали, в то время как в соматических клетках дейстиве этого агента не ощущалось бы, т.к. в них теломеразы нет. И наконец, в середине января 1998 года в американском журнале Science (N5349) появилась статья, взбудоражившая общественное мнение. Ее авторы сообщили об успешном эксперименте, в ходе которого удалось преодолеть Хейфлика в культуре клеток человека. Группе американского исследователя Дж. Шея с помощью генно-инженерных методов удалось ввести в геном соматичеких клеток человека ген теломеразы, снабженный регулирующими фрагментами ДНК, которые и заставили этот ген активно работать в тех клетках, в которых он обычно не работает. Авторы обнаружили, что длина теломер в этих клетках начала увеличиваться, так же как и продолжительность жизни клеточных культур: сверх обычных 50 делений клетки прошли 20 дополнительных. Результаты, приведенные выше, показывают, какую огромную роль в жизни организма играют маленькие фрагменты ДНК, расположенные на концах хромосом.
Теломерные районы хромосом имеют следующие свойства, сближающие их с гетерохроматином:
1. В состав теломер входят повторенные последовательности, число копий в кластере варьирует.
2. Теломеры обычно расположены на ядерной облочке.
3. Теломерные концы хромосом чаще всего создают ассоциации, т.е. теломеры разных хромосом конъюгируют.
4. Теломеры вступают в ассоциации с многими другими районами генома, в первую очередь с прицентромерным гетерохроматином и интеркалярным гетерохроматином.
5. В некоторых случаях (очень редко) в теломерных районах выявляется слабая С-окраска.
6. В политенных хромосомах теломерные районы представлены неполно т.е. теломерная ДНК недореплицирована (неполная политенизация).
7. Белок HP1 выявляется в теломерах.
8. Гены могут инактивироваться если перенесены в окрестности прицентромерного гетерохроматина (это свойство имеет название эффекта положения генов).
9. Есть данные о действии модификаторов эффекта положения на проявления свойств теломер.
6. Строение центромеры.
Центромера - специфическая область эукариотической хромосомы, которая играет фундаментальную роль в движении хромосом к полюсам деления и точного распределения вновь реплицировавшихся хроматид по дочерним клеткам во время митоза и мейоза. Частота ошибок в этих процессах невелика, но значительна. У дрожжей, например, частота нерасхождения хромосом составляет 10-5 или ниже. У человека частота нерасхождения хромосом выше, хотя большинство зигот с неразошедшимися хромосомами гибнет во время эмбрионального развития. Нерасхождение хромосом происходит в тех случаях, когда центромера нормально не функционирует. На ранних этапах подготовки хромосом к митозу центромера становится видимой как отчетливая морфологическая структура и выглядит как перетяжка хромосомы. Функция центромеры, по крайней мере частично, заключается в обеспечении прикрепления к хромосоме нитей веретена. Центромера имеет свой цикл поведения в митозе и мейозе. В митозе и во втором делении мейоза у сестринских хроматид центромеры сохраняют тесную связь друг с другом дольше других участков хромосомы и разделяются только в начале анафазы. В первом делении мейоза, напротив, центромеры гомологичных хромосом в каждом биваленте начинают отталкиваться первыми с началом анафазы I, при этом центромеры сестринских хроматид ведут себя как единое целое. Участок центромеры содержит кинетохор - обособленную структуру, контактирующую с центромерным районом, к которому прикрепляются микротрубочки-нити митотического веретена. Сформированный кинетохор метафазных хромосом представляет собой трёхслойную пластину, состоящую из внутреннего слоя толщиной 40-60 нм, светлоокрашенного среднего слоя приблизительно 25-30 нм толщиной и внешнего слоя 40-60 нм. Внутренние слои кинетохорной пластины располагаются рядом с хроматиновыми тяжами и его внутренняя поверхность взаимодействует с центромерным хроматином. Тонкие хроматиновые нити проходят сквозь средние слои и, оказывается, связаны с внутренним и внешним слоями. Микротрубочки, связанные с кинетохором, заканчиваются во внешнем слое, и редко протягиваются до среднего и внутреннего слоёв. Помимо микротрубочек, внешние слои содержат пушистую поверхность. или корону, состоящую из фибрилл, которые формируют петли наподобие ламповых щеток. В конце митоза кинетохор как специализированная структура исчезает. С молекулярно-биологической стороны организация кинетохора изучена очень слабо. Однако известно, что кинетохор содержит ДНК, ДНК-связывающие белки, возможно РНК и тубулин. Показано, что обработка ДНКазой хромосом млекопитающих специфично конденсирует структуру пластинки кинетохора, тогда как обработка РНКазой не влияет на неё. В настоящее время изучение организации центромерного района хромосом эукариот ведётся лишь на некоторых объектах. В 1980-е годы в центромерах дрожжей Saccharomyces cerevisiae были обнаружены последовательности, делеции которых приводят к утрате центромерной функции, что позволяет определить зону локализации центромеры на молекулярной карте. Центромерные районы у дрожжей называют районами CEN (от centromere) с добавлением цифры, обозначающей номер хромосомы. Сравнительный анализ центромер разных хромосом выявил важные закономерности в их структуре - центромерная ДНК всех хромосом дрожжей перекрёстно гибридизуется, что свидетельствует об их гомологии. Результаты полного секвенирования всего генома дрожжей показали наличие в центромерных районах всех 16 хромосом консервативных доменов CDEI (centromere DNA element I), CDEII и CDEIII. Хотя все центромеры имеют одну и ту же функцию, и центромерные районы очень похожим образом устроены, все же последовательности нуклеотидов в них не полностью идентичны. Элемент, называемый CDEI, во всех хромосомах имеет 7 консервативных нуклеотидов TCACATG. Далее следует фрагмент из 76-86 п.н. (число нуклеотидов в разных хромосомах разное). Это CDEII. Собственно нуклеотидные последовательности в каждой хромосоме разные, но в каждой из них доля AT-пар превышает 90% (в среднем 93-94%). Элемент CDEIII состоит из 25 п.н., из которых последовательность -G--G--CCGAA--, присутствует во всех 16 хромосомах. Делеционный анализ, выполненный на плазмидах, содержащих центромеры дрожжей, однозначно свидетельствует, что районы I-III необходимы для митотической стабильности автономно реплицирующихся последовательностей (ARS) плазмиды. Для осуществления центромерной функции необходимы не целые выше описанные элементы, а консенсусные группы. Так, делеция 5 левых нуклеотидов элемента I существенно не влияет на активность центромеры CENII, тогда как удаление АТ- богатой области (CDEII) полностью инактивирует центромерную активность. Высоко консервативный третий элемент (CDEIII) также принципиально необходим для осуществления центромерной функции. В нескольких работах было показано, что даже единичные делеции в этом районе полностью инактивируют центромеру. Центромерные последовательности ДНК определены для ряда других организмов. Они оказались отличными от тех, что были найдены у S. cerevisiae, и различаются у разных видов. Так, удругого вида дрожжей, S. pombe, центромеры имеют длину от 40 до 80 т.п.н. со сложным чередованием различных повторенных последовательностей. Таким образом, несмотря на то, что центромеры имеют одну и ту же функцию у всех живых организмов, не существует одинаковой последовательности ДНК, ответственной за выполнение этой функции. Каким образом центромерная ДНК организована в хроматин и каким образом происходит прикрепление микротрубочек? К настоящему времени выявлены некоторые типы белков, которые взаимодействуют с центромерой с микротрубочками. В этой модели CBF1 (centromere binding factor 1) связывается с мотивом CDE1; комплекс белков CBF3 связывается с CDEIII. Более длиннаяпоследовательность CDEII может быть предположительно обернута вокруг гистонового октамера. По-видимому, посредством линкерного белка, фактор CBF3 связывается с концом микротрубочки