II. Характеристика основных методов генетики человека с основами медицинской генетики

· Клинико-генеалогический метод (Ф. Гальтон 1883 г).

Суть метода: построение и анализ родословной.

Родословная - схема родственных связей в пределах одной или нескольких семей.

Этапы метода:

1.Сбор сведений как минимум о трех поколениях родственников пробанда - человека для которого составляется родословная.

2.Составление родословной.

3.Анализ родословной.

Метод позволяет установить:

1.Наследственный характер изучаемого признака.

2.Тип наследования признака(доминантный, рецессивный, аутосомный, сцепленный с полом, голандрический).

3.Зиготность членов родословной (гомозиготы или гетерозиготы).

4.Пенетрантность и экспрессивность гена, отвечающего за признак.

Правила построения родословных:
а) использование специальных символов;

б)символы, обозначающие особей одного поколения, располагаются строго по горизонтали;

в) сибсы(родные дети)одного поколения нумеруются арабскими цифрами;

· Близнецовый метод (Ф. Гальтон 1876 г.) - изучение генетических законо­мерностей на близнецах

Суть метода: установление роли наследственности и среды в фор­мировании отдельных признаков у человека, исходя из сходства и раз­личия монозиготных(однояйцевые-развиваются из одной зиготы) их обозначают МБ и дизиготныхих обозначают ДБ(разнояйцевые-развиваются из разных одновременно оплодотворённых яйцеклеток) близнецов.

Этапы метода:

1.Составление выборки близнецов.

2.Диагностика зиготности близнецов.

3.Определение степени конкордантности выборок близнецов по изучаемому признаку.

4.Вычисление коэффициента наследования.

Критерии зиготности близнецов:

У МБ всегда одинаковый пол, группы крови, рисунок кожных узоров;

У ДБ эти показатели различны; в редких случаях могут совпадать( кроме кожный узоров).

Формула Хольцингера

Н - коэффициент наследования

КМБ%-КОНКОРДАНТНОСТЬ у монозиготных близнецов.

КДБ%-КОНКОРДАНТНОСТЬ у дизиготных близнецов.

КМБ% - КДБ%

Н = ----------------------

100% - КДБ%

Конкордантность (сходство близнецов) - отношение числа близне­цов, у которых признак одинаков к общему числу выборки (выражается в процентах).

Дискордантность - различия близнецов по изучаемому при­знаку.

Если Н=1,0 за развитие признака отвечает только наследственность; если значение Н приближается к 0-за развитие признака отвечает преимущественно среда.

· Цитогенетический метод. Термин «цитогенетика» предложен Сеттоном в 1903 г. (1956 г.) - в кариотипе человека 46 хромосом.

Суть метода: - изучение кариотипа при помощи микроскопической техники.

Этапы метода:

1.Получение и культивирование клеток на искусственной пита­тельной среде (лимфоциты, фибробласты).

2.Добавление в среду ФГА для стимуляции деления.

3.Остановка деления клетки в метафазе колхицином.

4.Обработка клеток гипотоническим раствором NaCI (клетка разры­вается и хромосомы доступны окрашиванию).

5.Окрашивание хромосом специфическими красителями.

6.Микроскопирование и фотографирование хромосом.

7.Составление идиограммы и ее анализ.

Метод применяется для диагностики геномных, хромосомных му­таций, для установления генетического пола организма.

· Метод генетики соматических клеток (Барский 1960 г.) – изучение генетических закономерностей человека, используя его соматические клетки.

Особенности соматических клеток:

1.Имеют диплоидный набор хромосом.

2.Долго хранятся в замороженном состоянии.

3.Хорошо растут на различных питательных средах.

4.Быстро делятся митозом.

Существуют 3 разновидности метода:

а)клонирование (получение клона клеток);

б)селекция (отбор клеток с исследуемым признаком);

в)гибридизация (слияние клеток особей одного вида или разных видов с образованием гетерокариона и синкариона).

Метод позволяет изучать многие вопросы генетики человека в экс­перименте, устанавливать группы сцепления и строить цитологические карты хромосом.

· Популяционно-статистический метод - изучение генетического со­става популяции. Основан на законе Харди-Вайнберга, позволяет опре­делить частоту генов и генотипов в популяциях.

Биологическое моделирование - основано на законе гомологиче­ских рядов Н. И. Вавилова. На животных (мыши, крысы, собаки) модели­руют наследственные заболевания (создают мутантные линии сахарного диабета у крыс или гемофилии у собак и т. д.), изучают патогенез, разра­батывают методы диагностики, лечения и используют полученные дан­ные применительно к человеку.

Математическое моделирование - создание математических моде­лей генетической структуры популяции человека для прогнозирования ее изменений под влиянием антропогенных изменений окружающей среды. В рамках программы «Геном человека» создаются специальные компью­терные программы моделирующие функционирование генетической ин­формации, полученной при секвенировании НК.

· Биохимические методы - основаны на определении концентрации первичного белкового продукта гена, фермента или патологических ме­таболитов в моче, крови, или внутри клетки. Используются для диагно­стики наследственных болезней обмена веществ, развивающихся в ре­зультате генных мутаций. Количественные биохимические методы позволяют определить гете­розиготное носительство патологического рецессивного гена (фенилкетонурии) по скорости метаболизма пред­варительно введенного ФА. Если уро­вень ФА быстро нормализуется, то в организме достаточно фермента фени- лаланин-4-гидроксилазы и патологиче­ского гена нет, а если уровень ФА дли­тельно повышен, то фермента мало (человек является носителем этого ге­на).

Схема концентрации

ФА в крови

(часы)

выведение ФА

· Молекулярно-генетические методы (рекомбинантной ДНК). Метод позволяет обнаружить патологический ген в геноме.

1.Образцы ДНК пациента под действием рестриктаз разрезаются на бо­лее короткие фрагменты имеющие точки узнавания.

2.Полученные фрагменты разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле на фракции, отличающиеся размером (молекулярной массой).

3.Получение необходимого числа копий определенных фракций ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).

4.Тепловая денатурация размноженной фракции двухцепочечной ДНК на одноцепочечные фрагменты.

5.Помещение этих фрагментов в среду срадиоактивным зондом (одно- цепочечная ДНК, соответствующая патологическому гену). Если среди фрагментов ДНК имеется комплементарная зонду патологическая после­довательность, то происходит образование двухцепочечной ДНК.

6.Регистрация результата исследования происходит при помощи рентге- ночувствительной пленки.

· Методы экспресс-диагностики ("скрининг тесты", просеивающие

программы) - методы предварительной диагностики наследственных за-
болеваний.

1Дерматоглифический анализ - изучение гребешковой кожи. Применяется для диагностики врожденной компоненты наследственных заболеваний (при геномной
патологии отмечаются радиальные петли на 4 и 5 пальцах, ЧПБ, главный ладонный угол от 60° до 80° и др.) и для установления зиготности близнецов.

2. Химические методы (качественные цветные реакции). Для диагностики фенилкетонурии к мокрым пеленкам ребенка прикладывают бумагу, смоченную 10% раствором FeCI₃ (при наличие в моче ФПК – зеленоватое окрашивание).

3.Микробиологические тесты - основаны на свойствах бактерий нуждаться в определенных химических веществах для их нормальной жизнедеятельности.

Тест Гатри: кровь новорожденных, наносят на диски фильтровальной бумаги и помещают на агаровую среду, в которой находится штамм бактерий, рост которого подавлен антиметаболитом. Если концентрация ФА слишком велика, то отмечается бурный рост бактерий.

4.Биохимические: флюорометрические, хроматографические, ра-диоиммунологические экспресс-методы используют для быстрой предварительной диагностики наследственных болезней обмена.

5.Определение Х- и У- полового хроматина - исследуют клетки буккального эпителия или лейкоциты. Х-хроматин определяется при окрашивании ацеторсеином, а

Y- хроматин - акрихинипритом. Устанавливают генетический пол, диагностируют хромосомные ,болезни пола.

· Методы пренатальной диагностики (диагностика наследствен­ных дефектов плода на ранних стадиях беременности).

Непрямые методы (объект исследования - женщина): медико- генетическое, серологическое обследование и определение эмбрионспецифичных белков

(альфа- фетопротеин, хориональный гонадотропин) показаны всем беременным женщинам. Белки продуцируются клетками плода и пла­центы и поступают в кровь матери. Исследование проводится на 13-15 неде­лях беременности.

Уровень а-фетопротеина повышен :

а)при угрожающем выкидыше;

б)при внутриутробной гибели плода;

в)при Rh- несовместимости матери и плода;

г) при многоплодной беременности;

е) при дефектах нервной трубки;

ж) при врожденном нефрозе;

Низкий уровень альфа-фетопротеина отмечается при синдроме Дауна.

Прямые методы (объект исследования - плод):

1.Прямые неинвазивные методы показаны всем беременным женщинам, так как считаются безопасным для матери и плода.

Ультрасонография (УЗИ) - использование ультразвука для получения изображения плода и его оболочек. Метод применяется на 12-15 неделях беременности, позволяет выявить многоплодную беременность,грубые пороки развития нервной и опорнодвигательной системы.

2.Прямые инвазивные методы используются по показаниям, так как возможны осложнения (0,5-6 % случаев - выкидыш):

ü возраст старше 35 лет (риск синдрома Дауна повышен в десятки раз);

ü структурные перестройки хромосом у одного из родителей;

ü 1-й ребенок имеет болезнь с рецессивным типом наследования;

ü доминантно наследуемое заболевания у родителей;

ü при сцепленном с Х-хромосомой наследовании, если плод - мальчик;

ü беременность на фоне психологических травм, тяжелых заболеваний, неблагоприятного действия среды.

Хорионбиопсия (взятие эпителия ворсинок хориона) - проводится под кон­тролем УЗИ на 8-12 неделях беременности.

Хорион

Есть трансабдоминальный и трансцерви- кальный методы. Катетером с пластиче­ской канюлей, соединенной со шприцом, извлекают 10-25 мг ворсинок хориона.

Амниоцентез (взятие 20-30 мл амниотической жидкости с находящимися в ней клетками плода). Проводят на 15-17 неделе беременности трансабдоминально под контролем ультрасонографии.

Амниотическую жидкость исполь­зуют для биохимических исследований (генные мутации), а клетки хориона и пло­да - для цитогенетических исследований (хромосомные и геномные мутации). Методы позволяет диагностировать различные мутации в ранние сроки беременности.

Фетоскопияпроводится на 18-22 неделях беременности фиброоптиче- ским эндоскопом, вводимым под местным обезболиванием в полость ам­ниона через брюшную стенку матки.

Метод позволяет осмотреть плод, плаценту, пуповину и взять кровь пло­да из пуповины для диагностики наследственных болезней крови.

Недостаток метода - узкое поле зрения (ограничивает визуальную диаг­ностику патологии плода). В 5-10% возможен выкидыш.