Морфологические методы выявления Helicobacter pylori (HP)
Морфологическиеметоды выявления Helicobacter pylori достаточно надежны и их даже называют «золотым стандартом». В настоящее время существуют как гистологические методы диагностики геликобактериоза (поиск микроба в гистологическом биоптате слизистой оболочки желудка), так и цитологические методы (поиск микроба в раздавленном биоптате). Обнаружить Helicobacter pylori можно на обычных, окрашенных гематоксилином и эозином препаратах, если они достаточно тонкие и хорошо окрашены. Однако целесообразно проводить элективные методы окраски. Лучшими из них являются: по Граму, по Романовскому-Гимзе, по Вартину-Старри (кстати, именно при этой окраске биоптатов их и обнаружили в 1983 г.), акридиновым оранжевым, карболовым фуксином, толуидиновым синим. В зависимости от того, какая методика применяется в лаборатории лечебного учреждения, такую и целесообразно использовать, поскольку чувствительность их близка, хотя считаются более чувствительными окраски по Гимзе, Граму и акридиновым оранжевым (85% и 79% соответственно). При выполнении микробиологических и морфологических методов выявления Helicobacter pylori необходимо учитывать, что микроб обычно колонизирует неравномерно, и в биоптат могут не попасть колонии Helicobacter pylori. Для повышения точности исследования необходимо брать несколько биоптатов поднимаясь от пилорического отдела желудка к кардии (3-5 кусочков). Описанные методики не только достаточно дороги, требуют высокой диагностической техники, но и результат исследования получается через несколько дней (7-10). В настоящее время имеются методики, позволяющие достаточно легко проводить цитологическое выявление Helicobacter pylori в мазке желудочной слизи.
Helicobacter pylori в гистологических препаратах (цитологических) определяют при увеличении х 630, а лучше - х 1000. Оценивают степень обсемененности при увеличении х 630: 1) слабая степень - до 20 микробных тел в поле зрения, 2) средняя степень до 50 микробных тел в поле зрения; 3) высокая степень - более 500 микробных тел в поле зрения. Если исследования проводятся с использованием светового микроскопа при увеличении х 1000, то оценку обсемененности слизистой проводят по следующим критериям: «О» степень - нет микробных тел, «I» - 1-9 микробных тел в поле зрения, «2» - 10-29 микробных тел в поле зрения, «З» - 30-99 - микробных тел в поле зрения, «4» - 100 и более микробных тел в поле зрения (рис. 21).
Рисунок 21. Helicobacter pylori в биоптате слизистой оболочки желудка. Окраска по Гимзе, х 1000
Биохимические тесты выявления Helicobacter pylori (HP)
Для ускорения диагностики предлагаютсяинвазивные методики, дающие результат непосредственно во время исследования. Из них можно назвать такие биохимические тесты, как промышленно выпускаемые системы CLO- тест, Кампи-тест, Хелпил-тест и др.
Они основаны на способности Helicobacter pylori разрушать мочевину с образованием аммиака и углекислого газа. При этом в случае внесения биоптата в раствор мочевины с индикатором типа фенолрот меняется окраска раствора. Несмотря на высокую чувствительность, эти тесты могут давать отрицательные результаты в связи с отсутствием Helicobacter pylori в биоптате. В последнее время для повышения чувствительности исследования предложены иммунологические тесты, выполняемые непосредственно на слизистой желудка о время эндоскопии. Во время эндоскопии на слизистую наносят специальные антисыворотки против Helicobacter pylori или раствор мочевины с индикатором и по изменению окраски слизистой судят о наличии микроорганизма.
Значительно более простым и эффективным способом диагностики хеликобактериоза считается использованиенеинвазивных биохимических и иммунологических тестов.
Биохимические методы диагностики хеликобактериоза в настоящее время распространяются повсеместно. Они основаны на способности Helicobacter pylori расщеплять мочевину. Для исследования используется мочевина, меченная изотопами углерода С13 и С14. Это так называемые уреазные дыхательные тесты.
При их проведении пациент после пробного завтрака получает 20,0 воды, содержащей мочевину, меченную изотопом углерода. Спустя 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 120 минут пациент выдыхает воздух в специальный сосуд, содержащий вещества, связывающие выдыхаемый углекислый газ, или на специальную пластину. В зависимости от количества выделяемого меченного углекислого газа судят о наличии или отсутствии HP на слизистой желудка. Диагностическая чувствительность и специфичность данных тестов превышает 95%. Однако работа с мочевиной, меченной С13 и С14. требует очень дорогого оборудования (до 250000 долларов США), а изотоп С14 обладает радиоактивностью. Близкие методики предполагают использование мочевины, содержащей изотоп азота N15. По выделяемому с мочой меченному азоту в течение 2 часов получают результат исследования. Чувствительность этого метода составляет 96% при 100% специфичности.
В настоящее время в широкую практику входит уреазный дыхательный тест с использованием нерадиоактивной мочевины. В выдыхаемом пациентом воздухе автоматически определяется уровень аммиака, а не радиоактивного азота. Газоанализаторная аппаратура для этого исследования выпускается в нашей стране и отличается низкой ценой при высокой чувствительности и портативности.
Используемая в настоящее время диагностическая система Pronto Dry позволяет выявлять инфицированность Helicobacter pylori непосредственно при выполнении эндоскопического исследования в течение 5 минут. Для этого достаточно нанести на слизистую желудка специальный реактив и по изменению окраски судить о наличии или отсутствии Helicobacter pylori.
Биохимические методики диагностики хеликобактериоза в настоящее время считаются наиболее удобными для скрининг-диагностики и оценки эффективности эрадикации Helicobacter pylori.
ПЦР-диагностика
ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификации) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка.
Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при +94°C происходит разделение цепей ДНК, затем при +56°С - +60°C - присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре +72°C протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5` -3`.
В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями.
В мире накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) для выявления ДНК Н.pylori в биопсийном материале. Высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦР делают этот метод во многом революционным в лабораторной диагностике.